Maladies neuromusculaires - 15 novembre 2018 Flashcards
Quels sont les différents tests pour les maladies neuromusculaires?
- Gène unique
- Panel de gènes
- Séquençage d’exome
- Séquence du génome entier
- Séquençage d’ARN
En quoi consiste l’approche d’un gène unique?
On teste un gène, on attend le résultat et si c’est négatif, on teste un autre gènes.
Limite de l’approche d’un gène unique?
On doit toujours attendre, approche très longue et très coûteuse.
Dans quelle situation utilise-t-on l’approche par un gène unique?
Préféré quand la présentation clinique et les résultats des autres tests correspondent à une maladie particulière et est associée avec un gène spécifique.
Exemples de maladies musculaires diagnostiquées par approche de gène unique.
- Dystrophie musculaire de Duchenne
- Dystrophie musculaire de Becker
- Dystrophie musculaire facioscapulahumérale
- Dystrophie myotonique
Gène unique : Avantages?
- Peu de chances de VUS
- Directives de gestion médicale prouvées
- Pas de chances de découvertes fortuites
Gène unique : Limitations?
- Limité à un gène unique
- Dispendieux
- Haut risque de résultats négatifs
Gène unique : Quel est le rendement diagnostic?
20%
En quoi consiste l’approche par panel de gènes?
On choisit des gènes associés aux maladies musculaires et on séquence tous ces gènes dans une seule expérience. On obtient des données sur tous les gènes testés.
Dans quelle situation utilise-t-on l’approche par panel de gènes?
Préféré en présence d’une hétérogénéité clinique et génétique.
Exemples de maladies musculaires diagnostiquées par panel de gènes.
- Dystrophie musculaire compréhensive avec :
1) Panel myopathie (MNG)
2) Panel myopathie (MNG) + ARNmt
3) Myopathie (Invitae)
4) Panel de myopathie congénitale (Invitae)
Panel de gènes : Avantages?
- Gènes multiples dans un seul test
- Peu de chances de trouvailles fortuites
- Grande couverture des gènes candidats
Panel de gènes : Limitations?
- Limité à une liste de gènes pré-déterminés
- Haute chance de VUS
- Avoir une expertise spécialisée et des ressources
Panel de gènes : Quel est le rendement diagnostic?
25%
Qu’y ait-il arrivé avec l’arrivée du séquençage d’exome?
Augmentation fulgurante du nb de gènes et de maladies identifiées.
Dans quelle situation utilise-t-on l’approche par séquençage d’exome?
Préféré en présence d’hétérogénéité clinique et génétique.
Comment s’y prend-on pour faire un séquençage d’exome?
- Fragmentation de ADN génomique;
- On hybride pour aller capturer seulement les régions codantes.
- En capturant les régions codantes, on a une petite portion intronique qui va restée (+/- 10 paires de bases).
- Une fois la capture de notre région d’intérêt, ça va aller sur un séquenceur et les séquences obtenues peuvent être alignées avec un génome de référence et on peut identifier les variants.
Séquençage d’exome : Avantages?
- Pas de liste de gènes pré-déterminés
- Données peuvent être révisées
- Utilise moins d’ADN que le test par gène unique
- Moins coûteux et délai d’exécution plus rapide
Séquençage d’exome : Limitations?
- Haute chance de VUS
- Chances de découvertes fortuites
- Couverture absente ou inégale des gènes cibles
- Couvre seulement 2% du génome humain
- Avoir une expertise spécialisée et des ressources
Séquençage d’exome : Quel est le rendement diagnostic?
30%
Vrai ou Faux : Le séquençage du génome entier est très utilisé comme approche génétique.
Faux, très peu utilisé.
Quelle est la différence entre le séquençage d’exome et le séquençage du génome entier?
Dans le séquençage du génome entier, suite à la fragmentation de l’ADN génomique, on ne fait pas de capture de régions en particulier, on garde le génome au complet.
Séquençage du génome entier : Avantages?
- Pas de liste de gènes pré-déterminés
- Couvre les régions codantes et non-codantes
- Même couverture
- Plus approprié pour l’analyse des CNVs
- Données peuvent être révisées
- Utilise moins d’ADN que le test par gène unique
- Moins coûteux et délai d’exécution plus rapide
Séquençage du génome entier : Limitations?
- Haute chance de VUS
- Chances de découvertes fortuites
- Interprétation des variants introniques limitée
- Avoir une expertise spécialisée, des ressources et énorme charge de données
Quelle est la problématique majeure de ces approches?
Plusieurs patients atteints de myopathie ou de dystrophie musculaire n’ont pas encore de diagnostic moléculaire.
Hétérogénéité clinique ?
Un gène unique est associé avec différents phénotypes/présentations cliniques, âges de début et mode de transmission.
Hétérogénéité génétique ?
Un phénotype spécifique peut être associé avec des mutations dans différents gènes.
Quelles sont les 2 défis dans l’identification diagnostique des patients atteints de maladies musculaires?
1) Hétérogénéité clinique
2) Hétérogénéité génétique
Quelles sont les difficultés des approches utilisées actuellement pour le diagnostic moléculaire?
1) Les tests génétiques résultent souvent en une liste de VUS.
2) Les variants qui affectent l’épissage ou l’abondance de l’ARNm sont souvent non détectés (15% à 60%).
3) Les algorithmes computationnels pour prédire l’épissage prédisent incorrectement un nombre significatif d’évènements.
4) Au moins 30% des patients sont sans diagnostic moléculaire.
Quelle est la solution aux difficultés rencontrées avec les approches actuelles?
Le séquençage d’ARN.
En quoi consiste le séquençage d’ARN?
- On prend le muscle atteint;
- On extrait l’ARN;
- Dépendamment de l’approche ciblée, différentes façons de l’isoler.
- Sélection Poly-A : On choisit les ARN avec une queue poly-A avec une cible
- Déplétion ribosomique : cibles aléatoires, on va chercher des gènes poly-A et d’autres ARN
- Sélection par la grandeur : On fait une sélection par la taille pour seulement aller chercher les ARNs de petite taille (permet d’étudier les micro-ARNs, les ARNt).
- On convertit l’ARN en cDNA;
- On construit la librairie en ajoutant des séquences adaptatrices;
- Légère amplification par PCR pour enrichir notre cDNA;
- Séquençage et analyse.
Que doit-on faire avant de commencer le séquençage d’ARN?
On doit faire un nettoyage et un contrôle de qualité pour enlever les séquences de mauvaise qualité, et les duplicats créés par le PCR.
Quelles sont les 4 types d’analyses dans le séquençage d’ARN?
1) Variant calling
2) Évènements d’épissage
3) Expression différentielle
4) Fusion
En quoi consiste le variant calling?
Comparaison des variants du patient avec la séquence du génome de référence.
Variant calling permet de détecter ?
- SNV
- Petits INDELs
Variant calling : Quelles sont les voies de filtrage?
1) Qualité et couverture
2) Fréquence
3) Association avec la maladie
4) Information génique
5) Prédictions sur la pathogénicité
6) Score de conservation
Variant calling : Les voies de filtrage sont utilisées quand ?
On n’est pas certain du mode de transmission de la mutation.
Variant calling : De quoi dépend la voie utilisée pour le filtrage?
- Mode de transmission de la mutation
- Nombre de sujets atteints de la maladie
En quoi consiste les évènements d’épissage?
On identifie les variants d’épissage en comparant l’individu d’intérêt avec les contrôles et on quantifie les différents évènements d’épissage alternatif.
Évènements d’épissage : Quels sont les différents types d’évènements d’épissage alternatifs possibles?
1) Saut d’exon
2) Site d’épissage alternatif 5’
3) Site d’épissage alternatif 3’
4) Exons mutuellement exclusifs
5) Intron retenu
En quoi consiste l’expression différentielle?
On compare l’expression chez le patient versus un groupe contrôle pour voir s’il y a de différences.
Expression génique globale ?
Comparaison des read counts entre les patients et les contrôles.
Usage d’exon ?
Comparaison des read counts entre les patients et les contrôles au niveau de l’exon.
Usage des transcripts ?
Reconstruction des différents transcrits observés dans un tissu ou chez les patients.
Que retrouve-t-on dans l’expression différentielle?
- Global gene expression
- Exon usage
- Transcript usage
Quelle est la base de données pour mesurer l’expression dans les tissus?
GTEX
Quelle est l’utilisé de la base de données GTEX?
On peut voir un débalancement des ces expressions dans des pathologies.
Quels sont les meilleurs patients pour faire le séquençage d’ARN?
Patients qui ont eu beaucoup d’investigations et de tests, mais qui n’ont pas encore reçu de diagnostic moléculaire.
Séquençage d’ARN : Avantages?
- Étudie l’impact des VUS
- Augmente le rendement diagnostic
- Découverte de nouveaux gènes candidats
- Analyse de l’expression différentielle
De façon générale, que retrouve-t-on dans le génome humain au niveau des sites d’épissage?
Sites d’épissage forts et faibles.
Les sites d’épissage qui résultent en exons sont des sites d’épissage ?
Forts.
Comment se crée un pseudo-exon?
Mutation intronique qui crée un nouveau site d’épissage. La création de ce nouveau site d’épissage fait que le site faible devient un site fort et il est maintenant utilisé.
Quelle est l’avantage d’utiliser le muscle comme tissu à tester?
On peut trouver des mutations tissu-spécifique.
En utilisant le séquençage d’ARN, quelle est la différence que l’on voit avec l’ADN en terme de détection?
Avec l’ARN, on peut voir un débalancement allélique qui est muscle-spécifique, alors qu’avec l’ADN, on voit un ratio de 50%-50%.
Que permet le séquençage d’ARN?
- Conforme l’impact de VUS sur l’ARNm
- Confirme le diagnostic d’une maladie
- Identifie un nouveau gène potentiel d’une maladie
- Données d’expression donnent une indication sur 1) les mécanismes de mutation, sur 2) les voies dérégulées et sur 3) le niveau de dommage
Que suggère des gènes surexprimés?
Suggère que le muscle essaie de se régénérer, il est endommagé dû à la mutation mais essaie par compensation de se regénérer avec ces gènes qui sont impliqués dans le processus de régénération.
Que se passe-t-il lorsque la transmission du signal pour la contraction est défectueux?
On veut surexprimer des gènes de la matrice pour refaire cette contraction.
Fibrogénèse : Plus les gènes sont surexprimés, plus le muscle est …
Endommagé
Quel signe nous donne les gènes du complément au niveau du système immunitaire?
Signes de dommage aux muscles et signes d’inflammation au niveau du muscle.
Les fibres de type 2 utilisent ?
Le glucose comme métabolisme pour créer de l’énergie.
Que font les gènes du collagène?
Ils lient des composants de la matrice extracellulaire = indication de défauts du signal de transduction
Que sont les gènes impliqués dans la fibrogénèse?
Protéines de la matrice extracellulaire et des marqueurs de la fibrogénèse.
Quelles sont les différents gènes que l’on peut mesurer en regardant la signature transcriptionnelle avec le séquençage d’ARn?
- Gènes impliqués dans la contraction musculaire, la regénération et la différenciation
- Gènes du collagène
- Gènes impliqués dans la fibrogénèse
- Gènes du complément au niveau du système immunitaire
- Gènes du métabolisme du glucose
