Lezione 6 Flashcards
Cos’è la diagnosi indiretta
Una diagnosi che cerca l’anticorpo (o immunoglobuline) di un determinato antigene e stabilisce se l’ospite è venuto a contatto.
Serve il siero come campione
Per cosa è usata la diagnosi indiretta
Diagnosi di infezione, indagini epidemiologiche e valutazione di efficacia vaccinale
Il titolo anticorpale, cos’è?
È l’ultima diluizione in grado di provocare una reazione visibile a contatto con una concentrazione costante del corrispondente antigene
La diagnosi indiretta può dire se è presente il virus ancora vitale?
Generalmente no, la situazione cambia se questo virus dà infezione persistente come Retroviridae o Orthoherpesviridae
Quali sono i test a diagnosi indiretta?
- sieroneutralizzazione
- inibizione dell’emoagglutinazione
- immunofluorescenza
- ELISA
- test immunocromatografici
Test a sieroneutralizzazione, descrizione
Ricerca di anticorpi in grado di inibire la capacità infettante dei virus citopatogeni: in una coltura cellulare sono quelli che inibiscono l’adsorbimento del virus.
Valutano: presenza, quantità, capacità proteggente e sierotipo.
Gli svantaggi principali sono derivati dal fatto che la maggior parte dei virus non replica in coltura cellulare, e qua servono i virus vivi
Test di inibizione dell’emoagglutinazione (HI)
Ricerca anticorpi che impediscono l’adsorbimento virale a GB che, altrimenti, causerebbe emoagglutinazione.
Valuta quantità e sierotipo, lo svantaggio principale è che richiede eritrociti e ha un lungo tempo di esecuzione
Test di immunofluorescenza indiretta
Necessita di siero, antigene virale fissato e anticorpi anti anticorpi legati a una molecola fluorescente.
In caso di positività gli ab-antiab legano il complesso ag-ab ed emettono fluorecenza.
Valuta presenza e quantità
Test ELISA
Necessita di siero, antigene fissato su supporto, ab-antiab legato a enzimi per reazione colorimetrica.
In caso di positività gli ab-antiab legano complesso ag-ab e inducono la reazione colorimetrica nell’enzima che legano.
Valuta presenza e quantità
Test immunocromatografico ICT
necessita di siero, ab-antiab marcato con molecole colorate e ab-antiab fissato su supporto.
Sfrutta un flusso capillare: l’analita passa prima da una porzione che possiede ab-antiab colorati e poi su più porzioni con ab-antiab fissati su supporto. Se è presente l’anticorpo allora si lega al supporto e colora la zona.
Valuta la presenza.
Cos’è la diagnosi diretta
Una diagnosi che cerca direttamente l’AE o parti di esso (es. antigene).
Stabilisce se l’ospite è infetto al momento e occorre prelevare campioni idonei in base al suo tropismo
Quali sono i test a diagnosi diretta?
Per identificazione dell’intero AE:
- inoculazione in animale vivo
- isolamento virale
- ME
Identificazione di componenti:
- emoagglutinazione (HA)
- immunofluorescenza
- ELISA
- test immunocromatografico
Identificazione acido nucleico: metodiche molecolari
Inoculazione in animale vivo
Animale ricettivo da laboratorio, serve prelevare il campione in maniera sterile e deve essere mantenuto vitale.
Valuta la presenza, la vitalità e la patogenicità
Isolamento virale
Sfrutta la capacità di alcuni virus di crescere in vitro, necessita di un substrato cellulare e si valuta tramite l’effetto citopatico.
Valuta presenza, vitalità, citopatogenicità
Esistono diversi tipi di coltura cellulare.
Ha lo svantaggio del richiedere molto tempo, di una conservazione del campione e di possibilità di contaminazione
Quali sono i tipi di coltura cellulare per l’isolamento virale?
Coltura cellulare primaria, che deriva direttamente dal tessuto/organo e si mantiene viva per una decina di passaggi
Linee cellulari continue, che hanno derivazione embrionale/fetale e possono mantenersi vitali per numerosi passaggi.
Uova embrionate, con inoculazione in diversi tessuti a seconda del tropismo
Le cellule, inoltre, possono essere aderenti o in sospensione.
Tecnica della titolazione TCID50
Valuta il titolo virale infettante.
Consiste nell’inoculazione di volumi costanti di diluizioni della sospensione virale in 96 pozzetti con monostrato cellulare e successiva incubazione e lettura.
Al MO si valuta la citopatogenicità (CPE): la diluizione che causa CPE al 50% dei pozzetti corrisponde al TCID50
Tecnica della titolazione con il metodo delle placche secondo Dulbecco
Diluizioni seriali della sospensione virale in un monostrato cellulare in piastre.
Inoculazione di un volume costante di ogni diluizione virale in ogni piastra e copertura con terreno colturale semisolido. Incubazione e lettura.
Si conta il numero di placche al MO
Emoagglutinazione (HA)
sfrutta al capacità di alcuni virus di adsorbire eritrociti: se c’è l’antigene virale si determinerà l’agglutinazione
Serve solo per virus emoagglutinanti e può dare falsi positivi (presenza di altre prt emoagglutinanti) e non valuta la vitalità
Test a immunofluorescenza per analisi diretta
Anticorpi marcati con molecole fluorescenti: se c’è antigene c’è emissione di fluorescenza.
Valuta presenza, quantità e localizzazione
Test ELISA per analisi diretta
Il principio è simile a quello di analisi indiretta.
Se c’è l’ag si forma un composto ag-ab che induce la reazione colorimetrica del substrato
Presenza, quantità e localizzazione
Test immunocromatografico per analisi diretta
Funzionameno simile a quello per l’analisi indiretta.
Il complesso ag-ab si lega all’ab-antiab fissato sul supporto accumulandosi.
Valuta la presenza
Metodiche molecolari: generalità
Possono essere con (PCR) o senza amplificazione (sonde marcate).
Valutano un dato qualitativo e quantitativo, permettono sequenziamento e la localizzazione.
Un grandissimo vantaggio è quello di evitare la manipolazioen di agenti patogeni, tempi brevi e permette di differenziare virus vaccinali da quelli wild-type.
Non vlauta la vitalità ed è molto soggetta ad eventuali contaminazioni.
Quali sono le tipologie di provette
Contenitori universali: sterili senza anticoagulante
Provette per sierare: senza anticoagulante (centrifuga), con gel o granuli separatori
Provette con anticoagulante:
- viola con EDTA
- verde con eparina (inibisce DNApol)
- azzurro con citrato di sodio
- giallo con fluoruro di Na
Conservazione dei campioni
4-8˚C entro le 48h o -20 se +
Evitare scongelamento e congelamento perché causerebbe l’inibizione di DNApol
No ghiaccio secco, inibisce DNApol
