Les Methodes Flashcards
Dosage des protéines: objectif
Deux types de méthode et deux objectif: attribuer à chaques méthodes son objectifs
Troisième méthode pour les enzymes ?
Déterminer la quantité
Dosage global: colorant ou spectrophotométrie
Ici on mesure la quantité de protéine totale
Dosage spécifique: méthode immunochimique (ex: immunoprecipitation) dosage de la protéine d’intérêt spécifiquement
Dosage de l’activité (si enzyme activité proportionnel à sa concentration)
Purification: objetctif ?
Pourquoi faire ?
Isoler une protéine à partir d’un milieu complexe
Étudier les propriétés et la structure de la protéine
Concernant le suivi de purification:
Que représente Q ?
La quantité total de protéine dans le milieu
Concernant le suivi de purification:
Que représente l’activité total ? (AT)
Comment évolue cette valeur à chaUe étape ?
Quantité total de protéine d’intérêt dans le milieu !
↘️ a chaque étape
Concernant le suivi de purification:
Que représente l’activité spécifique ?
Comment évolue l’activité spécifique à chaque étape ?
Qu’elle est la formule pour la trouver ?
La quantité relative de protéine d’intérêt dans le milieu-> ration entre la quantité de protéine d’intérêt et le nombre total de protéine dans le milieu
↗️ a chaque étape
AS=AT/Q
Concernant le suivi de purification:
Qu’évalue le rendement ?
Qu’elle est sa formule ?
Évalué la perte de protéine d’intérêt ?
R=(ATn/AT0)x100
Concernant le suivi de purification:
Qu’évalue le niveau de purification ?
Que peut t’on dire de son ordre de grandeur ?
Formule ?
Évalué l’enrichissement en protéine d’intérêt
> 1
N=ASn/AS0
Concernant les méthodes de séparation:
La précipitation différentiel:
Principe général ?
Qu’elle est le critère de séparation ?
La Solubilité dépend de la nature, du pH et de la force ionique de la protéine
-> modification de ces caractéristique change la solubilité
La solubilité
Concernant les méthodes de séparation:
La chromatographie principe général ?
Critère de séparation ?
Est il possible de suivre l’elution grâce à l’absorbance vers 280 v
Deux phase, une stationnaire (papier) et une mobile liquide: séparation en fonction des force des interactions avec une de ces deux phases
Multiple: taille, pHi, hydrophobicité et affinité
Oui, c’est la longueur d’onde d’absorption des AA aromatique
Concernant les méthodes de séparation:
Eletrophorèses: principe générale ?
On fais migrer les molécules dans un support en les soumettants à un champ électrique. La migration et différente en fonction du milieu (pour chaque molécule)
Concernant les méthodes de séparation:
La chromatographie par exclusion-diffusion
Qu’elle critère de séparation ?
Qui est élue en premier ?
La taille
Les grosse molécules qui ne passe pas à travers les billes
Concernant les méthodes de séparation:
Chromatographie par échange d’ion: Principe
Dans qu’elle ordre son élue les protéine ?
Qu’elle critère de séparation ?
1) résine charger (+ CEA ou - CEC)
2) elle retient les molécule de charge opposée à la sienne tandis que les protéine de même charge ou null ne sont pas retenu
3) elution: on met en compétition les molécule retenu avec des ions du même signe qu’eu (opposer à la résine )
Donc plus l’élution et tardive, plus la molécule à un pHi opposer à la résine (qu’elle soit positive ou négative)
CEA-> pHi décroissant
CEC-> pHi croissant
Le pHi
Concernant les méthodes de séparation:
Chromatographie d’interaction hydrophobe ou en phase inverse
Qu’elle est la différence entre ces deux chromatographie ?
Principe:
Dans qu’elle ordre sont éluées les protéine ?
Qu’elle est le critère de séparation ?
La chromatographie d’inter. Hydrophobe ne dénature pas les protéines tandis que la chromatographie en phase inverse les dénature
On fixe des groupement hydrophobe sur une résine qui retient donc les protéine hydrophobe grasse à un gradient de sel élevé.
Puis on élu les protéine en diminuant le gradient de sel
Par hydrophobicité croissante
L’hydrophobicité
Concernant les méthodes de séparation:
La chromatographie d’affinité
Principe
Dans qu’elle ordre sont élué les protéines ?
Dérive: étude des interactions protéine-protéine: Principe ?
Qu’elle est le critère de séparation ?
On sépare les protéine en fonction de leur affinité pour un ligand
On fixe sur un support un ligand, les protéine ayant une affinité si fixe
Pour l’élution on peux utiliser un gradient de pH, de force ionique ou encore une solution contenant le ligand.
Elution par affinité croissante.
On fixe la protéine sur le support puis on fais une elution les protéines ayant une forte affinité pour la protéine testé interagisse avec elle
L’affinité à un ligand
Concernant les méthodes de séparation:
SDS-PAGE Principe ?
Qu’elle est le critère de migration
Qu’elle est l’ordre de migration ?
Comment ce fais la révélation ? (Deux exemple et ce qu’il permette )
Dérive: deux notion
En PAGE natif qu’elle sont les facteur qui intervienne ?
On place les protéines sur un support (PAGE) après les avoir mise dans un dénaturant (SDS) qui donne une charge négative à l’ensemble. On les place ensuite entre une cathode et une anode et on observe la migration après avoir révélé les protéines.
La taille
Les plus petites molécules migrent plus loin.
- bleu de coomassie révèle toute les chaînes
- AC spécifique révèle uniquement la protéine d’intérêt
1) Permet une étude demi qualitative en fonction de l’importance de la bande
2) permet une étude de la structure
-la forme intervient Ainsi que la taille.
