Lecture 4 Flashcards
Producción de aminoácidos mediante mutantes reguladores, bacterias inmovilizadas o enzimas
producción de aminoácidos por fermentación
1- Cepas de tipo salvaje
2- Mutantes auxotróficos
3- Mutantes regulatorios:
- Vías no ramificadas
- Vías ramificadas
Producción de aminoácidos por mutantes reguladores de vías no ramificadas: L-Prolina
La L - prolina se obtiene a partir del glutamato por fermentación con Serratia marcescens. Cuando hay un exceso de prolina, ésta se une a la glutamato quinasa inhibiendo su propia síntesis. Por lo tanto, necesitamos un mutante para la glutamato quinasa que no pueda reconocer la prolina. Para seleccionar el mutante utilizamos análogos estructurales tóxicos de la prolina, de modo que sólo crezcan las bacterias mutantes ya que estos análogos van a regular la acción de la enzima inhibiéndola por lo que no se va a obtener el producto final (en los no mutados), en caso de que la enzima este mutada no va a ser capaz de reconocer este análogo lo que significa que tampoco va a poder ser regulada por la L- prolina y de esta forma se elimina la inhibición por producto final. También necesitamos desactivar la prolina oxidasa (degrada la prolina). Al ser un osmoprotector, un medio con alta concentración de sal aumentará la producción de prolina como mecanismo de protección frente a estas condiciones de cultivo. Los genes de biosíntesis pueden sobreexpresarse por clonación.
Producción de aminoácidos por mutantes reguladores de vías no ramificadas: L-histidina
En el caso de la histidina debemos inhibir la histidinasa, así como inducir mutagénesis con selección por análogos estructurales para inhibir la retroalimentación de la adenilil transferasa. No se logró ningún aumento en la producción ya que la retroalimentación sólo se inhibió parcialmente; además, cuando se consiguió la inhibición total, la producción tampoco aumentó debido a la existencia de una vía adicional que no funcionó a un ritmo suficiente para recuperar ATP (enzima AICAR). Por lo tanto, se requiere un mutante que inhiba la histidinasa/adenilil transferasa mientras sobreexpresa AICAR.
Producción de aminoácidos por mutantes reguladores de vías ramificadas: Aspartato
A partir del aspartato se producen cuatro aminoácidos (isoleucina, treonina, metionina y lisina) que controlan tanto la primera enzima de su vía como la aspartato cinasa.
Producción de aminoácidos por mutantes reguladores de vías ramificadas: Aspartato E.coli
En el caso de E. coli existen tres aspartato quinasas, de modo que cada aminoácido (no la isoleucina) inhibe una sin bloquear totalmente la síntesis.
Producción de aminoácidos por mutantes reguladores de vías ramificadas: Aspartato B. flavum
En las bacterias del suelo (Brevibacterium flavum) que viven en medios con bajos nutrientes, la regulación es más fácil porque está controlada por sólo dos aminoácidos (lisina/treonina).
Para encontrar una cepa que produzca mayoritariamente lisina necesitaríamos sólo un mutante para la homoserina deshidrogenasa que disminuya su actividad lo que permite desplazar la vía metabólica hacia la producción de lisina. Utilizando análogos de lisina, se podría encontrar un mutante que haya inhibido la retroalimentación de la aspartato quinasa (sólo la treonina la regularía). Sin embargo, estos mutantes tienden a crecer peor que el organismo de tipo salvaje ya que la producción de los otros aminoacidos (metionina,treonina e isileusina) se encuentra disminuida.
Producción de aminoácidos con enzimas: características
- Permite la producción en altas concentraciones.
- Requiere pocos reactivos
- Tiene una tasa de producción muy alta por unidad de volumen, pero
- Requiere purificación de enzimas o reactivos de partida, por lo que es muy costoso.
Producción de aminoácidos con enzimas: Aspartasa para formar aspartato
La aspartasa degrada el aspartato para formar fumarato mayoritariamente ya que la Keq de esta reacción es de 20mM; sin embargo, en la industria la dirección de la reacción se puede invertir administrando fumarato. Necesitamos que la enzima realice una producción continua (se acaban inactivando) podemos:
- Unir la aspartasa a una columna y pasar una solución con fumarato
- Añadir una cepa de Escherichia coli (fijarla en la columna) que produzca activamente la enzima.
Dado que es una enzima de degradación debemos proporcionar aspartato al principio para inducir su expresión.
- La aspartasa también puede sobreexpresarse en E.coli bajo un promotor constitutivo o inducible que puede controlarse.
