Lecture 3 Flashcards
Producción de aminoácidos
Producción de aminoácidos
Todos los aminoácidos (20 aa) pueden sintetizarse industrialmente ya sea por:
- Síntesis química
- Hidrólisis de proteínas
- Fermentación directa
* cepas silvestres
* cepas modificadas
- Enzimas sintetizadas por microorganismos, rutas reguladoras
¿Qué es el L-glutamato?
Es un aa conocido por proporcionar el sabor umami y contribuye a diversos aspectos de la salud.
formación de L-glutamato
1) Inicialmente se producía por hidrólisis de proteínas, lo cual era bastante caro ya que había que separarlo del resto de aminoácidos.
2) Posteriormente se sintetizó químicamente, pero también fue un proceso costoso ya que hubo que separarlo de su isómero D-Glutamato (insípido).
3) Luego se descubrió una bacteria del suelo que segrega grandes cantidades al medio de cultivo (Corynebacterium glutamicum) iniciando la fermentación de cepas silvestres de Actinobacteria, Firmicutes o Proteobacteria para la producción industrial de aminoácidos.
Compuestos que afectan la producción de glutamato.
La biotina influye en la producción de glutamato, por lo que agregarla al medio de cultivo aumentó la producción, pero agregar demasiada la disminuyó.
Se sabe que la ausencia de biotina altera la función de la enzima reguladora OdhI al bloquear el ciclo de Krebs. La enzima reguladora OdhI controla el complejo enzimático 2-oxoglutarato deshidrogenasa (ODHC) de modo que, cuando se desfosforila, es capaz de inhibir el complejo deteniendo el ciclo de Krebs (el 2-oxoglutarato se convierte en L-glutamato). OdhI también facilita la expresión de un transportador de membrana para glutamato que permite su acumulación fuera de la membrana.
En condiciones normales, el ciclo de Krebs funciona en una versión truncada, a través del ciclo del glioxilato, manteniendo la producción normal de glutamato. Cuando se alcanza una alta densidad de cultivo, esta vía se inhibe parcialmente, aumentando la producción de glutamato.
Regulación de la biosíntesis de aminoácidos en E. coli.
1) Control de la actividad de enzimas preexistentes: Se trata de la inhibición por retroalimentación, como ocurre en la síntesis de prolina a partir de glutamato (cuando hay grandes cantidades de prolina, ésta se une a la primera enzima de su síntesis inactivándola).
2) Control de la síntesis de nuevas enzimas:
- Represión: El producto final de la vía (cuando se sobreexpresa) se une a una proteína reguladora o represor inactivo (ArgR) provocando un cambio conformacional que permite su unión a la región promotora inhibiendo la transcripción al bloquear la unión de la ARN polimerasa.
- Atenuación: el bloqueo del mRNA se controla, por ejemplo, en el operón triptófano, en el que la región líder tiene la capacidad de formar estructuras secundarias por emparejamiento de regiones -> Cuando hay mucho Trp pasa rápidamente de la región 1 a la región 2 de forma que las regiones 3 y 4 forman un bucle terminando la transcripción; por el contrario, cuando hay poco Trp el ribosoma se queda atascado en la región 1 formando un bucle entre las regiones 2 y 3 que no tiene efecto sobre la ARN polimerasa.
Producción de intermedios biosintéticos por mutantes auxotróficos: L-Ornitina
La L-Ornitina es un intermediario en la síntesis de arginina por lo que, para sintetizarla, debemos obtener un mutante auxotrófico para la arginina que carece de actividad ornitina transcarbamilasa, que es la primera enzima de la vía (L-Ornitina + ornitina transcarbamilasa = L-Citrulina ).
¿Cómo se pueden identificar los mutantes auxótrofos de arginina que no presentan actividad ornitina transcarbamilasa?
Para identificar el cultivo auxótrofo seleccionamos las cepas que nos son capaces de crecer en medio mínimo pero que sin son capaces de crecer cuando le añadimos el compuesto final de la ruta metabólica ( en este caso arginina que se usa como nutriente limitante para mantener una función fisiológica normal y evitar la activación de los mecanismos de retroalimentación). Esto no es suficiente porque como tenemos reacciones intermedias en las que participan otras enzimas, podríamos estar seleccionando mutantes para cualquiera de esas enzimas. Para seleccionar el mutante de interés debemos colocarlo en un medio de cultivo que contenga el compuesto (citrulina en una cantidad controlada para no reducir la síntesis de ornitina por retroalimentación) que se debe obtener normalmente por la enzima que se quería mutar, donde debe crecer. Por tanto debemos combinar todos estos procedimientos para la selección.
