Lecture 2 Flashcards
Producción de proteínas
Pasos en la producción de proteínas
Para obtener las proteínas, primero debemos separarlas del resto de componentes celulares y, una vez obtenido el pool de proteínas, utilizaremos técnicas cromatográficas para aislar la proteína de interés.
Técnicas cromatográficas para el aislamiento de proteínas
-Absorción: separación por afinidad de la proteína a la matriz por enlaces de hidrógeno y/o fuerzas de Van der Waals -> Elución por gradiente aumentando la concentración de fosfato.
-Afinidad: interacción específica con el ligando unido covalentemente a la matriz -> Elución por cofactores, sustratos, cambios de pH o concentración salina.
-Quelación de metales: por matrices que contienen iones metálicos unidos por los que la proteína tiene afinidad -> Elución con soluciones de ligando que se unen al metal y desplazan a la proteína.
-Filtración en gel: separación por tamaño molecular (las proteínas voluminosas eluyen primero) con una fase estacionaria compuesta de polímeros porosos.
-Intercambio iónico: separación según la carga (punto isoeléctrico) por fuerzas electrostáticas dependientes del pH de la solución -> Matriz de celulosa sustituida por grupos cargados (cationes o aniones) o elución en gradiente aumentando la concentración de fosfato.
-Hidrofobicidad: por interacción con matrices que contienen grupos funcionales hidrófobos -> Elución por alteración de la fuerza iónica o cambio del pH.
-Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): a alta presión utilizando columnas con matrices de sílice.
¿Qué permite la diálisis y la electrodiálisis?
Eliminación de iones inorgánicos y/o pequeños solutos de la preparación mediante ósmosis y/o uso de membranas recubiertas con resinas de intercambio iónico
¿Cuántas columnas se utilizan para la purificación de proteínas?
Casi ninguna proteína se puede separar utilizando una sola columna de cromatografía, sino que se utilizan varias columnas, detectando la fracción en la que se encuentra la proteína deseada, y utilizándola en otra columna, hasta obtener finalmente la proteína purificada. Una vez obtenida se debe verificar la pureza y actividad específica.
¿Qué grado de pureza necesitamos para la proteína?
Depende de la aplicación de la proteína, siendo baja en aplicaciones industriales (85-90%) pero alta en ciencia, alimentación o farmacéutica (100%). Después de la purificación se debe comprobar la temperatura ideal de almacenamiento, para que no se produzca pérdida de actividad, así como el efecto de los aditivos.
Producción de proteínas recombinantes.
La producción de proteínas recombinantes en huéspedes heterólogos requiere manipulación genética, aunque la purificación es la misma que si el huésped fuera nativo, con la ventaja de que el rendimiento es mayor ya que se produce más cantidad de proteína, debemos recolectar todas las fracciones para comprobar el procedimiento.
expresión nativa (+) vs. expresión heteróloga (-)
+ Estructura funcional correcta
+ Expresión constitutiva
+ Producción limitada
+ Modificaciones postraduccionales
+ Proteína nativa
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- Estructura funcional indefinida
- Expresión constitutiva o inducible
- Sobreexpresión
- No modificada en procariotas
- Cuerpos de inclusión
¿Para qué se utilizan las etiquetas de afinidad?
Las etiquetas de afinidad son una serie de aminoácidos adicionales que se añaden al final de la proteína recombinante para facilitar los procesos de purificación permitiendo, por ejemplo, el uso de una única columna de purificación. Se pueden agregar a ambos extremos de la proteína, pero se debe verificar que no alteren la actividad de la proteína. En muchos casos, tienen conectores asociados que proporcionan sitios de escisión reconocidos por proteasas específicas (linkers), lo que permite eliminar la cola de afinidad.
También existen etiquetas de solubilidad (solubility tags) que aumentan la solubilidad de la proteína a través de la modificacion de su plegamiento. Un mismo marcador puede tener un segmento que sea de afinidad, uno que aumente la solubilidad y un linker.
¿Cómo se puede mejorar la producción de proteínas?
Para mejorar la producción, se pueden utilizar modificaciones del huésped, como mejorar los sistemas de transporte, aumentar la eficiencia de los sistemas de producción, modificar el contenido de chaperonas (facilita el plegamiento de proteínas) o eliminar proteasas.
¿Existe algún problema en la expresión de proteínas eucariotas?
A la hora de expresar proteínas eucariotas tenemos un problema, ya que la proteína está determinada por su mRNA (sin intrones) lo que requiere el uso de transcriptasa inversa para obtener cDNA a partir del mRNA modificado. También existen diferencias de tamaño debido a modificaciones postraduccionales.
tipos de enzimas de restricción
Clase I: escinde entre 100 y 1000 pb del sitio de reconocimiento y actualmente tiene un uso limitado
Clase II: escinden muy cerca de una secuencia de reconocimiento específica y se utilizan para escindir ADN doble en sitios específicos; Consisten en una proteína que escinde el ADN y la segunda metila el ADN.
Clase III: escinden 25/27 pb de su sitio de reconocimiento; la misma enzima realiza ambas funciones, modificación y restricción (dependientes del ATP).
¿Dónde deberían producirse estas enzimas de restricción?
Un mismo microorganismo puede producir varias enzimas de restricción, lo que dificulta los procesos de purificación (→ debe ser del 100%). Por tanto, es útil la producción heteróloga de estas enzimas en microorganismos tales como Escherichia coli; sin embargo, este último debe protegerse de la propia enzima de restricción, ej: añadiendo una metiltransferasa adecuada.
Entre las enzimas utilizadas en la industria alimentaria, me gustaría que hablaras de la transglutaminasa.
La transglutaminasa es una enzima que permite que las proteínas se fusionen uniendo el CO - NH2 de la glutamina con el grupo NH2 de la lisina (con liberación de amonio) generando cadenas interconectadas que aportan mayor retención de agua o elasticidad, además de prevenir la formación de espumas. Se obtiene de Streptomyces ya que tiene mejores rangos de temperatura o pH. Generalmente se usa en productos alimenticios, especialmente productos cárnicos, pero puede ser útil para generar estructuras para hacer crecer células humanas con el fin de reparar tejidos dañados.
enzimas para la producción de biocombustibles
Existen enzimas vegetales para la degradación de las fibras vegetales con el fin de obtener azúcares que pueden convertirse en combustibles por fermentación (biocombustible de 1ª generación). Posteriormente, se descubrieron microorganismos que producían estas enzimas de forma natural, por lo que llevan a cabo la producción de azúcares y su transformación (biocombustible de 2ª generación).
