LC-MS Flashcards

1
Q

Hva er HPLC systemet og instrumenteringen?

A
  • teknikk man bruker for å separere, identifisere og kvantifisere hver komponent i en blanding
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Av alle instrumentene til HPPLC, hva er viktigst for oss?

A
  • mobilfasen som brukes
  • separasjonskolonnen man har
  • hva slags detektor.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Hvorfor øker retensjonstiden med økende lengde på kolonnen?

A

Fordi det er mer materiale(sorbent) i en lenger kolonne for analytten å interagere med. Gjør at analytt bruker lenger tid på å passere gjennom kolonnen, og øker retensjonstiden.

kan separere forbindelsen bedre da de får lenger tid der.
kan ikke bli for lenge, er kostbart.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Hva er retensjonstid i HPLC?

A
  • Tiden det tar for analyttmolekylet å passere gjennom kolonnen og nå detektor.
  • kan påvirkes av faktorer som molekylets affinitet for stasjonær fase, egenskapene til mobil fase og kolonnens fysiske egenskaper.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Hva er k`?

A

Kapasitetsfaktoren, eller retensjonsfaktor.
Beskriver grad av interaksjon mellom analytter og den stasjonære fasen ift den mobile fasen.

høy k`–> analytt bruker er tid i stasjonær fase, og gir lenger retensjonstid. Betyr det er mer vann i mobilfase enn acetonitril

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Hva er en sorbent? Hva består den som oftest av i HPLC?x

A

det er materialet som brukes om stasjonær fase i kolonnen. Det e den analytten i prøven skal interagere med under separasjonsprosesser.

Vanligvis av silika som er kjemisk modifisert og har funksjonelle gr på overflaten.

str på partikkel, form, pore str og funksjonelle gr har stor betydning for separasjonen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

hvorfor er smal partikkel str best for HPLC?

A

Mindre partikler og mindre porer kan gi bedre separasjonen ved å øke overflatearealet for interaksjon.

Jo smalere partikkel str, jo smalere topper får man pga bedre separasjon.

større partikler har dårlig evne til å separere og gi smale topper. De har også smalere vindu med optimal funksjon.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Eddy diffusjon blir mindre med mindre partikkel str, forklar

A

Det er et fenomen som oppstår når partikler tar ulike veier gjennom kolonnen. Store partikler har større varians i sti, og gir bredere topper.

redusert partikkel ser, ensartet sti, og eddy diffusjonen minker, gir skarpere topper.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Masseoverføring i mobilfase blir større med økende mobilfasehastighet, forklar.

A

Referer til hastigheten hvor analytten flytter fra den mobile fasen til stasjonær fase og tilbake. gunstig for separeringen.

analyttene har mindre tid til å equilibrere (komme i likevekt) mellom den stasjonære fasen og mobilfasen. Dette kan resultere i bredere topper

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Longitudinal diffusjon minsker med økende mobilfasehastighet, forklar

A

dette er spredning av analyttmolekyler langs kolonnenes lengdeakse pga konsentrasjonsgradienter.

høy mobinfasehastighet gjør at analytter bruker mindre tid i kolonnen, og dermed mindre tid til å spre seg.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Hva har partikkel str 1,7 vs 6 mikrometer å si for sensitivitet og for separasjon av to forbindelser som eluerur nært hverandre?

A

Sensitivitet:
- mindre partikkelstr fører til høyere kolonneeffektivitet og skarpere topper. Analyyten gir da et mer sterkere signal og er lettere å detektere.
- med skarp topp er det lettere å skille fra bakgrunnsstøy, og da lettere å detekterer.
- God sensitivitet gir evnen til å se lave konsentrasjoner.

  • smal partikkel str er også bedre fordi, om vi fortynner den vil den toppen enda synes da halvparten forsvinner. Men med bredere topper er det vanskeligere om 50% forsvinner da de vil bli enda mindre.

Separasjon
- smal partikkelstr separeres bedre.
smale partikler reduserer båndspredning, som er viktig for forbindelser som har lik affinitet for den stasjonære fasen, og da kan sluere sammen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Hva er tailing?

A
  • referer til en uønsket effekt i kromatografi der en peak har en asymmetrisk form med en forlengelse på siden, noe som kan føre til unøyaktig kvantifisering og dårlig oppløsning.
  • årsaken til tailing kan være:

mer enn 1 interaksjoner mellom analytt og sorbent

overbelastning av kolonne eller dårlig kolonnepakking. –> gir fronting, venstrelent tail(noen analytter kommer ut for tidlig)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Hva er kravet til mobilfaser i HPLC?

A
  • Høy renhet - avhengig av detektor
  • bør ikke gi utslag på detektoren som bnyttes
  • inert overfor analytter
  • må løse analytten og andre forbindelser i prøven.
  • risiko vurdering ift helse og miljø.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Hva bruker man som mobilfase i normalfase HPLC?

A

-upolare løsemidler som For eksempel heksan, heptan

  • retensjonen på kolonna vil øke med økende mengde upolare mobilfase.
  • heksan som mobilfase gir For eksempel lang retensjonstid.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Hvilke to måter benyttes mobilfasen for HPLC?

A
  • isokratisk eluering
  • gradient eluering
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Hva betyr isokratisk eluering?

A
  • sammensetning til mobilfase er samme hele tiden. man lager på forhånd klar en løsning med en bestemt sammensetning, for omvendt fase HPLC For eksempel 20% metanol og 80% vann.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Hva betyr gradient eluering?

A
  • her endres mobilfasesammensetningen underveis i analysen. krever to eller flere ulike flasker med mobilfase. for omvendt fase HPLC kan de to flaskene innehold For eksempel 100% metanol og 100% vann.
  • kan gå fra svak mobil fase til sterk mobilfase.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Hva er fordeler og ulemper ved isokratisk vs gradient eluering?

A

iso fordeler:
- enkel instrumentering
- kun en mobilfase
- ingen ekvibilrering mellom prøver

gradient fordeler:
- velegnet for komplekse blandinger
- smale topper selv ved lang analysetid
- en separasjon kan ofte gjøres raskere enn ved sokratisk eluering

ulemper iso:
- kan bli lang analysetid
- uegnet for komplekse blandinger
–> dersom en forbindelse bakerst krever 95% metanol, så må iso kjøres på 95% metanol, men da kan det hende de første forbindelsene ikke separeres godt nok og fyker ut samtidig. lavere metanol enn det, kan hende de bakerste ikke kommer ut før lenge.
- brede topper ved lang analysetid.

ulemper gradient:
- mer kompleks instrumentering
- flere mobilfaser
- ekvilibrering påkrevd mellom hver analyse, øker analysetiden.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

mobilfase 30% vann og 70% acetonitril har en topp som kommer tidlig, hvorfor?

A

Det regnes som en sterk mobilfase siden andel organisk løsemiddel reduserer polariteten til mobilfasen. en sterk mobilfase vil interagere mer med de hydrofobe delene av analytten og føre til at den passerer raskere gjennom kolonnen, noe som gir en:

lav k` verdi og kort retensjonstid!!!

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

mobilfase 80% vann og 20% acetonnitril får en topp langt bak, hvorfor?

A

Her er mesteparten av den mobilefasen vann, og dermed er det en svak mobilfase. den interagerer svakere med hydrofobe delene av analytten og analytten vil derfor interagere sterke med den hydrofobe stasjonærfasen og passere saktere gjennom kolonnen, og gi en høy k`vedi og lang retensjontid.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Hvordan kan vi endre selektiviteten for å optimalisere omvendt fase HPLC-metode?

A

selektivitet beregnet med alfa er et mål på hvor godt to analytter kan skilles fra hverandre under HPLC-analysen.

to hovedmåter å endre selektiviteten:
1. endring av den kjemiske overflaten på kolonnen (For eksempel ved å bytte fra en c18 til ionebytter kolonne). kan endre antall teoretiske plater N, som er mål på kolonnens effektivitet.

  1. endring av kjemisk sammensetning til mobilfasen.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
22
Q

Hvorfor er tailing ugunstig for sensitiviteten og separasjonen?

A
  • tailing faktor til 1,2 er vanlig.
  • en lavere topp grunnet tailing vil være vanskeligere å detektere over støy, så den reduserer metodesensitiviteten.
  • halen til toppen vil kunne overlappe de påfølgende forbindelsene og gjør det vanskeligere å skille dem.
  • kromatografiske system integrerer areal under topp for å kvantifisere mengden til en forbindelse, og asymmetriske topper og tailing gir feil kvantifisering.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
23
Q

hva forårsaker tailing?

A
  • mer enn en interaksjon mellom analytt og sorbent.
  • overbelastning av kolonne.
  • for å unnaå tailing, unngå kolonner med en eller annen form for modifikasjon for å hindre restsilanolgruopper i å binde seg til analytten.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
24
Q

hva er fronting? hva skyldes fronting?

A

det er at toppen er asymmetrisk, men i motsatt retning enn ved takling.

fronting skyldes at man overbelaster kolonna ved å injisere for mye prøve. alle aktive posisjoner i starten av kolonnen blir tatt, og molekyler som ikke finner noe å binde seg til beveges direkte videre inn i kolonnen og treffer ledig plass.

molekylene som beveger seg raskere gjennom starten av kolonnen, vil eluere ut tidligere enn de andre. noe får altså forsprang og kommer ut tidligere.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
25
Q

Hvordan unngå fronting?

A
  • fortynne prøven, da forsvinner problemet fordi.
  • reduserer overbelastning siden høy kons av analytt kan overbelaste kolonnen.
  • sikrer at interaksjon mellom analytt og stasjonærfase er mer kontrollert og konsistens.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
26
Q

Hva er HILIC kolonne?

A
  • det er en kromatografisk teknikk som brukes for å skille polare forbindelser.
  • den gir lignende type kromatografi som det man ser i normalfase kromatografi, hvor polare analytter separeres basert på interaksjon med en polar stasjonærfase.
  • de er nyttige for å analysere polare analytter som ikke bindes godt i omvendt fase kolonner, hvor ikke-polare analytter er målgruppe for separasjon.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
27
Q

Utfordring med HILIC?

nedprioriter. kan egt ikke

A
  • vanskelig å oppnå skarpe definerte topper, spesielt for svært polare analytter.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
28
Q

Hvordan gi bedre kromatografi for ladde forbindelser?

A
  • tilsette ionisk forbindelse til mobilfase som binder seg til ioniske grupper på analytten. gir bedre kromatografi for ladde forbindelser.

kan også brukes til å få bedre retensjon på vannløselige forbindelser.

vanlig å tilsette TFA når man analyserer peptider.
den bindes til positivt ladde aminosyrer i peptid og gir bedre kromatografi.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
29
Q

Hva er massespektrometri?

A

Er en metode som måler vekten av enkeltmolekyler. Måler masse-ladningsforholdet m/z.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
30
Q

nevn masseseptrometrene:

A

singel/trippel quadrupol
time of flight - ToF
orbitrap
magnetisk sektor

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
31
Q

Hva er en ionekilde for LC-MS, nevn noen

A

ionekilder som brukes i væskekromatografi-massespektrometri, er teknikk for å ionisere prøven før massespektrometri.

En er ESI - elektrospray ionisering

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
32
Q

forklar ESI

A

Elektrospray ionisering (ESI) er en teknikk brukt i væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) som omdanner molekyler fra væskefasen til ioner i gassfasen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
33
Q

Hva er monoisotopisk masse vs molekylvekt?

A

molekylvekt er den gjennomsnittlige masse nav et molekyl basert på gj.s masse av isotopene også.

Monoisotopisk masse er kun massen til det mest forekommende isotoper som For eksempel karbon 13.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
34
Q

Hva skjer i en ESI, altså ved ionisering av basiske forbindelser?

A

basiske forbindelser som citalopram, er en proton akseptor og tar da imot protoner(H+).

den blir til citalopram + H+.
får pos ladning

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
35
Q

Hva skjer i ESI, ved ionisering av sure forbindelser?

A

Sure forbindelser er proton donorer.

For eksempel naproksen vil da gi fra seg H+, og dermed bli

naproksen - H+. Negativ ladning

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
36
Q

Hvilke andre ioner kan dannes ved ESI/APCI enn (M+H)+ og (M+H)- ?

A

hvilke ioner som dannes avhenger av hvilke ioner som er i prøven og mobilfasen.

positiv ionisering: Na+, K+ og NH4 addukter.

negativ ionisering: Cl- og CH3COO-.

kan For eksempel få Citalopram + Na+ eller Naproksen + Cl-

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
37
Q

Hva er ionesuppresjon?

A

når tilstedeværelse av en annen forbindelse påvirker ioniseringen og dermed intensitet av signalet av annen forbindelse.

kan gjøre at et signal på 100 blir 80.

38
Q

Forklar hva en trippel quadrupol er ?

A

Den består av tre deler som er Q1, q og Q2, som er kvadrupolmasseseparatorer.

Q1: den første kvadrupolen som fungerer som et masseselektivt filter som lar bare ioner med en bestemt masse-til- ladningdforhold (m/z) passere gjennom.

q - er en kollisjonscelle for å indusere fragmentering av de valgte forelder ionene som har passert Q1. Skjer ved å kollidere ionene med en gass i q, som gjør at ionene brytes ned til mindre fragmenter.
Denne er også an hexa- eller octapol.

Q2 - er den tredje kvadrupolen som fungerer som et andre massesepektrometer, og detekterer de fragmenterte ionene som ble generert i kollisjonscellen.

39
Q

Forklar hvordan kollisjonscellen fungerer?

A
  • ioner kommer inn i kollisjonscellen, hvor ioner da har blitt filtrert av Q1 først.
  • gassen i kollisjonscellen er inert, og reagerer ikke kjemisk med ionene, men funker som et medium for fysiske kollisjoner.
  • trykket er høyere enn i kvadrupolene, trykk er viktig for å optimalisere kollisjonene.
  • ioner kolliderer med gassmolekylene og går at ionene får ekstra energi og fragmenterer til mindre ioner.
  • fragmenterte ioner, forklater cellen til neste Q2.
  • Deretter til detektor som registrerer ionene ved å omdanne det fysiske treffet av et ion til et elektrisk signal.
40
Q

Hva skjer i detektor etter Q2?

A
  • i q2 separeres fragmentene etter massen. ionene treffer så detektoren, og det finnes to typer detektorer:
    –> Fotomultiplikator
    –> Elektromultiplikator.
41
Q

Hva er time of flight MS?

A

Det er en metode som brukes i massespektrometri for å måle massen til ioner. Prinsippet bak ToF er basert på å måle tiden det tar for ioner å reise en kjent avstand i instrumentet.

Ioner med ulik masse vil da bruke ulik tid gjennom instrumentet. Denne tiden måles og brukes til å beregne massen til ionene ut i fra flyvetiden.

De lette ionene får høy fart og kommer fortere ut enn de tyngre.

42
Q

Hva betyr Quadrupol-time-of-flight?

A

Beskriver MS som kombinerer egenskapene til kvadruopolmasseselektor med TOF.

Her brukes elektrisk felt for å filtrere ioner basert på deres m/z.

Kvadrupolen her brukes for å velge spesifikke ioner for fragmentering.

TOF - måler tid det tar for ioner å reise en kjent avstand. Tiden er avhengig av m/z-verdien.

43
Q

Hva er en ionefelle MS?

A

Ionene fanges og går i bane inne i en ringelektrode. Massen bestemmes ved å endre på den elektriske potensialene i de ulike elektrodene.

44
Q

Hva er en magnetisk sektor MS?

A

Her brukes et magnetisk felt for å separere ioner med ulike m/z.

De som ikke har m/z området vil kollidere i veggen, mens de som har m/z innenfor ønsket range går videre for detektering.

45
Q

Hva er en orbitrap MS?

A

Det er en høyoppløselig massebestemmelses teknikk. i orbitalen blir ioner fanget i et elektristatisk felt og oscillerer rundt en sentralelektrode.

Ionene beveger seg i orbitaler mellom en indre og en ytre elektrode. Orbitalene vil avhenge av m/z for ionene, og massen kan beregnes ut i fra de målte orbitalene.

46
Q

Hva er spesielt med moderne orbitrap MS?

A

Man kan fragmentere ioner flere ganger. altså fragmentere molekylioner til fragmenter, også velge ut ett eller flere fragmenter som man fragmenterer igjen.

47
Q

Forklar fullscan?

A

her detekteres alle ionene som passerer gjennom MS over et bredt masse-til-ladning (m/z) område. Det gir et komplett masse spektrum som representerer alle komponentene i prøven innenfor oppgitt (m/z) område.

  • masse støy
48
Q

Selected ion recording(SIR/SIM) forklar.

A

Metode hvor kun ioner med spesifikke m/z verdier blir detektert og registrert. Det er en mer følsom teknikk enn full scan fordi spektrometeret fokuserer på et mindre antall ioner, og det reduserer bakgrunnsstøy og øker signal-noise forholdet(mindre noise).

49
Q

Forklar multiple reaction monitoring (MRM/SRM)

A

er kvantitative teknikker som brukes for å måle bestemte analytter med høy følsomhet og spesifisitet.
i MRM velger man en parent ion og datter ioner. kun spesifikke overganger blir monitorer, og gir spesifikke signaler for de analyttene som er av interesse.

50
Q

Forklar product ion scan

A

Det er en metode hvor man først isolerer et parent-ion og deretter fragmenterer det for å produsere datter-ioner. MS detekterer da alle fragmentnionene som dannes. Det gir detaljert info om struktur til parent ionet.

51
Q

Forskjell på GC-MS og LC-MS for fragmentering?

A

GC-MS: får ofte fragmentering i EI ionekilden slik at både molekylion og fragmenter dannes.

LC-MS: Her brukes oftest en ioniseringsteknikk som ikke gir fragmentering (myk ionisering). Her ioniseres de bare og får ladning. Dersom den skal fragmenters kommer det i MS delen i kvadrupol f.ek.s

Fragmentene
kan brukes til å enten få kvalitativ informasjon og molekylet (strukturrelatert
informasjon) eller til kvantifisering.

52
Q

Hvilke kollisjonsgass i kollisjonscella brukes da i kollisjonsaktivert dissosiasjon?

A

Ofte edelgass som He for å unngå at kollisjonsgassen reagerer med ionene og danner nye produkter istedenfor fragmenter.

53
Q

Hva kan fragmentering brukes til?

A

strukturoppklaring
strukturbekreftelse
i kvantitative analyser

54
Q

Hva er massenøykatighet?

A

Massenøyaktighet i massespektrometri er et mål på hvor nær den målte massen (m/z-verdien) er den faktiske eller teoretiske massen av et ion.

lav ppm –> høy massenøyaktighet

55
Q

Hva er styrker og svakheter til LC-trippel quadrupol MS?

A

Styrker:
- robust
- lineært område: stort lineært område betyr at det kan produsere nøyaktige, proporsjonale analytiske signaler over et bredt konsentrasjonsområde av analytter.

  • bra til kvantitative analyser av kjente forbindelser: den er selektiv og kan detektere spesifikke molekyler ved å bruke flere m/z filtre. den er sensitiv for deteksjon av lave kons av analytter. kan analysere flere komponenter i enkelt kjøring.

svakhet:
- unøyaktig måling av m/z
- dårlig oppløsning
- dårlig følsomhet ved full scan metoder.

56
Q

Hva vil det si at instrumentene er unøyaktig i måling av m/z?

A

om man bruker flere desimaler ved utregning av monoisotpoisk masse til et molekyl vil man få nøyaktig masse.

men quadropolen klarer ikke å måle nøyaktig nok siden den har lav massenøyaktighet og oppløsning. Får bare med 1 desimal

57
Q

Hva vil det si å ha dårlig oppløsning?

A

Det er å kunne skille mellom to masser som ligger nært. quadrupol instrumentet vil ikke se forskjell på desimaler til masser.

58
Q

Hvorfor har trippel quadrupol MS dårlig følsomhet ved full scan?

A
  • Når et spektrometer gjør fullscan, detekteres alle ioner over et bredt masseområde.
    signalet blir da fordelt over mange m/z-verdier og reduserer intensiteten av individuelle signaler for hver m/z.
  • inkluderer mye bakgrunnsstøy
  • full scan modus bruker instrument mye tid på å scanne gjennom bredt spekter av m/z verdier.
  • trippel quadrupoler er optimalisert for høy følsomhet for MRM for kvantifisering.
59
Q

Når bruker ToF instrument?

A

når man trenger høy massenøyaktighet eller høy oppløsning/behov for å gjøre fullscan analyser.
- eks er protemikk, metabolomikk og lipidomikk.H

60
Q

Hva er proteomikk?

A

analyse av alle proteiner i en prøve. her er det behov for fullscan analyse fordi man ikke vet hva man forventer å finne i prøven. I tillegg er prøvene ofte komplekse, og høy oppløsning og høy massenøyaktighet er nød for å identifisere proteinene.

-kan bruke orbitrap her for bra fullscan, oppløsning og massenøyaktighet.

61
Q

hva er metabolomikk?

A

analayse av alle metabolitter som dannes gjennom cellulære prosesser. her er det behov for fullscan analyser med høy oppløselighet og høy massenøyaktighet. med høy massenøyaktighet og oppløsning kan man gi strukturinformasjon om eventuelle aktive forbindelser

62
Q

hva er lipidomikk?

A

analyse av alle lipider i tilsvarende typer prøver som man gjør proteomikk og metabolomikkanalyser.

63
Q

Hva er orbitrap og trippelkvadrupol?

A

En Orbitrap og en trippelkvadrupol er begge typer massespektrometriinstrumenter som brukes til å identifisere og kvantifisere kjemiske forbindelser basert på deres masse-til-ladningsforhold (m/z).

De måler m/z til molekyler.

64
Q

Hva kan orbitrap brukes til?

A

Metabolomikk og lipidomikkanalyser. kan lete etter biomarkører for sykdom Og så videre…

65
Q

Hvordan regne massenøyaktighet, og hva slags verdi er bra?

A

regnes ved å ta differansen mellom målt masse og teoretisk masse.

massenøyaktighet lavere enn 1 ppm er bra.

66
Q

Vil høy eller lav logP ha høyest retensjonstid i omvendtfase HPLC?

A

Forbindelser med en høy logP-verdi, som indikerer at de er mer hydrofobe, vil generelt ha en lengre retensjonstid i et LC-MS-system. Dette skyldes at de hydrofobe forbindelsene vil ha sterkere interaksjoner med den hydrofobe stasjonære fasen i kolonnen og vil bruke lengre tid på å eluere enn mer hydrofile forbindelser.

67
Q

Hva er monoisotopisk masse?

A

det er molekylets vekt basert på de mest vanlige forekommende isotopene. dette er vekta man måler i et massespektrometer, her måler man vekte til enkeltmolekyler.

68
Q

Hva er molekylvekt?

A

gj.s vekten av et stort antall molekyler der man har en naturlig fordeling av isotopene i molekylene. Det er vekta man benytter når man skal veie ut en forbindelse på analysevekt.

69
Q

Hva er forskjell fra 13C fra 12C?

A

Karbon 13 er en stabil isotop av karbon med en ekstra nøytron sammenlignet med det mer vanlige karbon 12.
den veier da 1 atommasseenhet høyere.

Så 1 masseenhet forskjell sier at det er karbon 13 som er tilstede.

70
Q

Hvordan fungerer en trippelkvadrupol HPLC-MS?

A

det er et system som kombinerer separasjonskapasitet til høyeffektiv væskekromatografi med detektorens nøyaktighet og følsomhet til MS.

  1. prøven injiseres til hPLC system, går via en kolonne med mobilfase. Komponenter i prøven separeres basert på kjemisk egenskap og interaksjon med stasjonær fase.
  2. analytt eluerur fra kolonnen til ulik tid.
  3. MS: de eluerte komponentene blir så ionisert ved bruk av ESI.
  4. Q1: ionene sendes så via kvadrupolmassespektrometer, og velger da ut spesifikke m/z verdier ved bruk av massefilter.
  5. q2: valgte ionene passerer q2 hvor de blir fragmentert ved kollisjon med inert gass.
  6. q3: ionene analyseres av q3 som igjen fungerer som et massefilter for å detektere bestemte fragmenter.
71
Q

hva er fullscan vs SIR vs MRM?

A

FULLSCAN:
- skanner q1 gjennom et bredt spekter av m/z verdier, og alle ionene detekteres i q3. Gir da et komplett MS av prøven, som er nyttig for generell analyse og identifikasjon av ukjente forbindelser.

SIR:
- her velger SIR modus Q1 en spesifikk m/z verdi eller et smalt område av m/z. dette er for sporing av en bestemt ion. det gir høy følsomhet og nøyaktighet for måling av et bestemt molekyl.

MRM:
- velger Q1 et bestemt forelder ion basert på dens m/z-verdi og Q3 er satt til å detektere et spesifikt fragmention etter kollisjon i Q2. Denne brukes for høy følsomhet og selektivitet i kvantifisering av bestemte forbindelser.

72
Q

Hvordan er signalene for fullscan, sir og mrm?

A

fullscan. gir bredt spekter av data og er nyttig for å identifisere mange komponenter i prøven. mindre sensitiv enn sir og mrm, og har mer støy.

sir: høy følsomhet for enkeltioner, men kan ikke skille mellom forbindelser med lik m/z verdi

mrm: gir høy følsomhet og selektivitet for kvantifisering av målforbindelser, selv i komplekse prøver.

73
Q

hvordan funker orbitrap?

A

en type massespektrometer som funker på en helt annen måte enn de mer tradisjonelle kvadrupolMSene.

Kjent for høy oppløsning og nøyaktighet i massedeteksjon.

  1. prøve ioniseres
  2. ionisert molekyl injiseres inn i orbitrap.
  3. går inn i ionefellen hvor de fanges langs en elektrode. positivt ladde ioner tiltrekkes til de negativt ladde elektrodene.
  4. MS: ioner av ulik m/z forhold vil ha ulike oscillasjonsfrekvens , og strømmen blir målt.
  5. med målt frekvens og kjent m/z forhold kan analyttene identifiseres og kvantifiseres.
74
Q

Har orbitrap eller kvadrupol best kvantifisering?

A

trippelkvadrupol
- ofte foretrukket for kvantitative analyser pga deres evne til å utføre MRM, som gir høy følsomhet og nøyaktighet.
- MRM tillater også kvantifisering ved lave konsentrasjon nivåer.

–> BEST KVANTIFISERING

orbitrap
- er mindre følsomme enn trippelkvadrupoler når det gjelder kvantifisering av mengder.

75
Q

Har orbitrap eller kvadrupol best oppløsning?

A

Orbitrap tilbyr høyere oppløsning enn trippelkvadrupol. de kan skille mellom masser som er veldig nær hverandre.

76
Q

Hva betyr oppløsning?

A

det beskriver instrumentets evne til å skille mellom to ioner som har lik masse til ladningsforhold m/z. Høy betyr da at den er flink til å skille mellom ioner med nær m/z, og gir to separate signaler i MS.

Dette har orbitrap og det ser vi på deres MS siden de får opp isotoper. gir da detaljert spekter av forbindelser med like masser.

77
Q

hva betyr kvantifisering?

A

Referer til evnen til å måle nøyaktig hvor mye av en gitt forbindelse som er tilstede i prøven. Ikke bare deteksjon men også evnen til å korrelere intensitet av et ion signal med konsentrasjonen av det tilsvarende molekylet i prøven.
- MRM er bra her
- kan si nøyaktig hvor mye av hver forbindelse som er i prøven selv med lav kons.

78
Q

Hva brukes som mobilfase for omvendt fase HPLC?

A

Vann, metanol, acetonitril og andre organiske løsemidler som er blandbare med vann brukes som mobilfaser. Justeres gjerne med pH med en syre, base eller buffer.

79
Q

Hvorfor øker retensjonstiden i omvendt fase HPLC med økende mengde vann i mobilfase?

A

Her brukes ofte en ikke-polær stationær fase, som vanligvis er bundet silika med lange hydrokarbonkjeder (for eksempel C18-kjeder).

Når vann, som er polart, øker i den mobile fasen, blir den totale polariteten av mobilfasen også høyere. Dette gjør det vanskeligere for polar analytt å bevege seg gjennom den ikke-polare stationære fasen fordi det er mer løselig i den polare mobilfasen. Som et resultat beveger polar analytt seg saktere gjennom kolonnen og retensjonstiden øker.

80
Q

Hva er en omvendt fase HPLC?

A

I omvendt fase HPLC har man en stasjonær fase laget av små silikat kuler som er modifisert med ikke-polare kjemiske grupper. Den har da en upolar karakter.

Mobilfasen derimot som er den flytende delen som strømmer gjennom kolonnen og transporterer prøven gjennom det upolare mediet.

Den mobile fasen består av en blanding av vann eller et vannbasert organisk løsemiddel som metanol eller acetonitril.

Når prøve injiseres, vil komponenter i prøven som er upolare ha sterkere interaksjon med ikke-polar stasjonær fase og bevege seg sakte gjennom kolonnen enn de polare forbindelsene som blir trukket med mobil fase.

Blir til slutt detektert og vi får målt tiden det tok for stoffet å passere gjennom kolonnen. Informasjonen brukes til å identifisere og kvantifisere stoff i prøven.

81
Q

Hvorfor må man være obs på ladning i omvendt fase HPLC?

A

Det er fordi vi vil analytten skal binde seg til stasjonær fase og ha interaksjon der og ikke mobilfase. Når man har en syre gr så kan den ionisere og danne ladning.

De som har ladning er mer polare enn polare, og da vil den binde mobilfasen og eluere raskt enn å interagere med stasjonær fase og sluere sakte. De får kort retensjonstid dersom de har ladning.

82
Q

Hva vil man sikre seg når det kommer til omvendt fase HPLC sin mobilfase og pH?

A

Man bør velge pH som er rundt 2 enheter lavere eller høyere enn analyttens pKa for å sikre at analytt blir fullstendig protoner eller deprotonert.

83
Q

Nevn isotopene til H, N, O, Br, Cl

A

H1, H2
N14, N15
O16, O18
CL35, CL37
Br79, Br81

84
Q

Hva er ESI?

A

Det er en teknikk for å produsere ioner fra molekyler. Det er en myk ioniseringsmetode og kan produsere ladde versjoner av molekylet.

når ionisering skjer vil MS detektere ulike m/z verdier for de ioniserte molekylene.

85
Q

Hva er en positiv ionisering?

A

Her kan molekyler ioniseres positivt ved å legge til et proton og danne M+H.
Molekyler kan også binde seg til andre positive ladninger som Na og K for å danne addukter.

86
Q

Hva er negativ ionisering=

A

Det er når molekylet ioniseres ved å ta vekk et proton og danne M-H. Kan også skje ved å danne addukter med CL-.

87
Q

Styrker og svakheter ved LC-Q-ToF MS?

A

styrker:
- robust
- god massenøyaktighet
- høy oppløsning
- god sensitivitet i fullscan

svakheter:
- ofte mindre lineært område enn quadrupol
- dyr

88
Q

Hvilken nytte har vi av høy massenøyaktighet?

A
  • finne elementsammsetning til en ukjent forbindelse eller bekrefte elementsammensetningen til en kjent forbindelse.
  • eks skille mellom massen på de.
  • 4 siffer bak komma er optimalt.
  • Flere topper hos orbitrap
  • PPM –> sier noe om hvor nær vi er faktisk masse.
  • får følsomt fullscan og kan analysere proteomikk osv f.eks med ToF.
89
Q

Hvorfor er LC- trippelkvadrupol MS bra til kvantitative analyser av kjente forbindelser?

A

Stort lineært område
* God evne til å filtrere bort støy ved bruk av SIR og MRM
* Dette gir kromatogram med lite interferens fra andre forbindelser enn vår
analytt, og godt signal/støy forhold

90
Q

Hva vil det si at instrumentet har et stort lineært område?

A

Dette vil si at det er en lineær sammenheng mellom konsentrasjon og signal over et
stort konsentrasjonsområde sammenlignet med andre typer MS instrumenter.