GC-MS Flashcards
hva er en GC-MS?
står for gass kromatografi-massespektrometri og er en analysemetode som kombinerer funksjonene til gasskromatografi og massespektrometri.
GC skiller og analyserer komponenter som kan fordampes uten å dekomponere. Prøver varmes og fordampes og føres gjennom en lang kolonne fult med et fast materiale (stasjonær fase) vha en gass som helium som mobil fase.
komponenter i prøven vil migrere gjennom kolonnen med ulik hastighet avhengig av kjemiske egenskaper og polaritet og separeres når de forlater kolonnen.
Hva er MS?
Massespektrometri som er teknikk for å identifisere kjemiske komponenter på molekylært nivå basert på deres m/z.
prøven separeres i GC eller LC, ioniseres og føres inn til MS. Her brytes de ned til ioner og masse bestemmes.
Hva kan man analysere i GC?
forbindelser som:
- vi kan få over i gassfase
- høy MW
- forbindelser med polare funksjonelle gr.
- kombinasjon høy MW og polare funksjonelle gr.
- å være termostabile forbindelser.
kan man analysere forbindelser som er for polare til å analysere på GC?
Ja vha derivatisering gjør vi at den polare gr er mindre polar.
- etter derivatisering får forbindelsen høyere MW, men lar seg greit analysere på GC.
nevn de to klassiske derivatiseringsteknikkene?
COOH omdannes til metylester, MW øker med 14 dalton
OH omdannes til TMS eter, MW øker med 72 Da for hver OH gruppe som derivatiseres.
TMS . eter ( trimetylsilyl)
GC instrument hvordan fungerer den?
- har mobilfase (carrier gas) som er inert gass som helium eller nitrogen og brukes til å transportere prøven gjennom kolonnen.
- flow controller: for å kontrollere strømmen av carrier gas og sikrer t den er konstant gjennom analyseprosess.
- injector port: prøven introduseres til systemet. prøven varmes og fordampes.
- kolonne: rør er fylt med stasjonær fase der separasjon av komponenter finner sted. Temp styres nøye for for at komponenter kan eluere ulik tid.
- detektor detekterer komponentene og identifiserer endringer.
- recorder: lager et chromatogram. lager grafisk representasjon av detektorsignalet. hver topp representerer en komponent i prøven.
Forklar injeksjon av prøve på GC?
Prøve løses i upolar organisk løsemiddel, som heksan.
mer komplisert enn LC.
Hva ønsker vi med vår injektor?
måten vi injiserer på må ikke ødelegge kolonnens evne til å lage smale topper.
forholdet mellom ulike analytter i prøveløsningen må være den samme når de kommer inn i kolonnen.
Hva er en splittløs injektor for GC motsetning til splittinjektor?
- mest vanligste å bruke.
- er noe som introduserer flytende prøve direkte inn i hele strømmen av bærergassen og deretter inn i kolonnen i motsetning til splittinjeksjon hvor kun en liten fraksjon av den injiserte prøven når kolonnen og resten blir ventet ut gjennom en splittventil.
basically –> splittløs injektor sørger for at hele prøvevolumetk blir overført til kolonnen.
Hvordan fungerer en splitt og splittløs injektor?
- sprøytenål stikkes gjennom rubber septum og nål går inn i liner.
- trykk på stempel på sprøyta.
- løsemiddel og analytter går spontant over i gassfase.
- gassfase overføre stil kolonnen vha av bærergassen.
Hvis volumenne i injektor er 1 ml vil det ta minst et min før alt av analytt og væsken den er løst i er overført til kolonnen. Går det bra?
Nei, den fraksjonen av en analytt som kommer først inn i kolonnen(ila noen sek) vil starte å vandre gjennom kolonnen. De molekylene som kommer sist, vil alltid være et min bak. Dvs at vi får topper minst 1 min brede. kolonnen har kun evnen til å lage topper som er 5-6sekunder brede i kapillarkolonner hos GC typisk.
Hva er viktig med en kolonne?
At den bevarer sin evne til å lage smale topper.
ingen diskriminering mellom analytter(dvs at mengde forholdet mellom ulike analytter i løsningen er den samme når analyttene er kommet inn i kolonnen).
Hva er grunnen til at analytter vandrer raskt eller langsom i en GC-kolonne?
temperatur i kolonnen er årsaken. ved lav temp sitter analyttmolekylene stille.
Finnes to typer GC-kolonner:
kapillar kolonne:
- lange, tynne
- tyngt lag av stasjonær fase på innsiden av røret. stasjonærfase er det som gjør at forskjellige komponenter i prøven separeres basert på deres relative affinitet for denne fasen vs bærergassen.
Pakket kolonne:
- fysisk pakket stasjonær fase, ofte et fast materiale eller en væske på et solid bærermateriale. ofte kortere
Hva er viktig i en kapillar kolonne i GC med mobil fase som bærergass?
At alle er inerte, dvs at ingen interaksjoner mellom bærergass og analytt forekommer. derfor ingen effekt på k´eller alfa.
eksempler er H2, He
Hva er båndspredning i gasskromatografi?
det er når analyttmolekylets detektbare signal sprer seg over tid enn å forbli i et skarpt, veldefinert topp. skjer når analyttmolekyler ikke beveger seg gjennom kolonnen med nøyaktig samme hastighet, og gjør at de blir spredt utover og skaper en bredere topp.e
Er båndspredning ønsket eller ikke?
Ikke ønsket fordi det reduserer oppløsning mellom ulike komponenter i en prøve og gjør det vanskeligere å identifisere og kvantifisere komponentene. Jo smalere topp jo bedre separasjon og oppløsning i kromatogrammet.
Hvordan måles båndspredning?
ved å beregne antall teoretiske plater, N, som er et mål på kolonnens effektivitet. N i formen til Rs
Hva er to fenomen som også kan gi båndspredning?
Longitudinal masseoverføring og masseoverføring i mobil fase.
Hvilke tilfeller kan analytt ha høy og lav diffusjonshastigheten i GC?
analyttmolekyl diffunderer raskere med lette H2 molekyler rundt vs når det er tyngre molekyler som He rundt.
De med lette rundt seg reiser altså raskere gjennom kolonnen.
Dm(H2) > Dm(He)»_space; Dm(N2)
Analyse tar lang tid med N2.
Hva skjer i likningen med lav u og ved høy u (bærergasshastighet) i likning: H = A + Cl * Dm/u + Cm*u/Dm?
Lav u gir høy Dm og det skaper problemer.
Høy u gir problemer i andre litt hvor Dm ønskes stor. H2 er da bedre enn Hr. Begge er bedre enn N2.
Hvorfor er riktig kolonne viktig?
For eksempel for bra separasjon, bra retensjonstid så ikke alle hoper seg opp, bra oppløsning.
Hva sier alfa i den formelen i GC?
Refererer til selektiviteten eller relativ retensjonsfaktor som er et mål på hvor godt en kromatografisk kolonne kan skille mellom to komponenter.
hvordan endre på alfa i GC formel?
- endre stasjonær fase med annen polaritet og funksjon, endre interaksjon mellom analytter og den stasjonære fasen som påvirker retensjonstiden.
endre temp, det påvirker fordampingshastigheten til analytt.
- endre bærer gass kan endre strømningshastigheten.
- endre kolonne diameter
Hva må til for best mulig separasjoner vha av GC?
- Rett bærergass
- Rett bærergasshastightt
- Gode injeksjonsrutine
- Rett kolonne: passe tykk stasjonærfasefilm, rett stasjonærfase kjemi.
- Bra temp
Hva gjør EI- ionekilden i en GC-MS?
Den lager ioner av nøytrale molekyler. Kan også bruke kjemisk ionisering.
Hva er den mest vanligste ionekilden i GC-MS?
Det er EI - elektron ionisering.
Sendes strøm gjennom og varmer den opp, og da damper elektroner av.
Elektroner dras mot den positivt ladede anoden.
Når analytt molekyler kommer inn i strømmen av elektroner vil de bli ionisert og som ion sendes de videre inn i mS instrumentet.
vanlig reaksjon her er å få dannes M+ + 2e
Hva skjer når et nøytralt molekyl kommer inn i GC-MS?
Når analytt er separert ledes den inn i MS og blir ionisert. Analytt vil miste et elektron som danner positivt ladde molekyl ioner.
De kan være ustabile og bryte ned til mindre fragmenter, som resulterer i fragmentioner med ulik m/z. Dette skjer fordi ionene får høy intern energi etter ionisering og det kan bryte bindinger.
passerer på kvadrupol og sorteres etter m/z.
hver topp i MS representerer hver topp i et ion med spesifikk m/z.
Forklar begrep: Molekylion
Dette er ionet som representerer det intakte molekylet som har mistet et enkelt elektron under ioniseringsprosessen i MS.
Den har m/z-verdien lik molekylvekten av det opprinnelige nøytrale molekylet.
Forklar begrep: Base peak
Det er det mest intese ionet i et MS, dvs det ionet som har den høyeste relative intensiteten.
Ofte et fragment ion.
Altså det høyeste i MS spekter
Forklar begrep: fragmentioner
Ionene som dannes når molekylionet brytes ned til mindre stykker eller fragmenter. De har levere m/z verdier enn molekylionet og representerer ulike deler av det opprinnelige molekylet.
Hjelper med å bestemme struktur til opprinnelig molekyl basert på hvordan det brytes ned.
Basically fragmentioner
Hvordan vite om vi har observert molekylionet M+? en metode
Velg høyeste m/z verdien.
om vi vet at molekylet inneholder et eller flere N –> bruk N regelen.
- 1 stk N, da betyr det at vi tror M+ er et oddetall.
- om høyeste m/z = 189 For eksempel så styrker det troen på at m/z = 189 er molekylionet.
N - REGEL?
Antall N: 0, 2, 4, 6
Molekylion: partall
Fragmention: oddetall
Antall N: 1, 3, 4, 5, 6
Molekylion: oddetall
Fragmentioner: partall
Gi annen måte å testefor om vi har observert molekylionet M+?
kan se på massedifferanse mellom kandidaten til M+, og massen til det første tonet med lavere masse.
Eks høyeste masse: 189, og nest er 130.
189-130 = 59
m/z= 59. det er naturlig tap.
Styrker at m/z c= 189 er M+. Må finne biter av organisk molekyl som veier 59 –> i tabell.
Tap av 59 er metylester.
Hvorfor kunne identifisere M+?
Gir sikrere kvantitative analyser
mulighet til å beregne antall
C i molekyl og element sammensetning
sikrer identifisering av antatt kjent forbindelse.
Hva er en CI ionekilde?
Referer til type ionekilde som er brukt i kjemisk ionisering.
enn å bombardere analyttmolekylene direkte med høyenergetiske elektroner som i EI, så introduseres reaktiv gass som metan eller ammoniakk. Den gassen ioniseres først, og resulterende ionene overføres så til et proton til analyttmolekylet for å danne (M+H)+.
Fordel her er at CI generer ioner på mykere måte og gir mindre fragmentering. Så MS er nklere å tolke. bra når analytt ikke tåler hard ionisering via EI.
Hva er myk ionisering?
Det forekommer når man bruker CI ionekilder. Her skjer det da en mildere ionisering og ikke på like hard måte som EI.
Det gjør at vi kan overføre et molekyl fra nøytral til ionisert tilstand med minimal energitilførsel. Så molekyl blir ionisert uten å bryte opp i mange fragmenter. Myk ioniseringsmetode er viktig når man ønsker å bestemme moleyklvekten av intakte molekyler eller analyse forbindelse som lett kan dekomponere eller ikke tåler EI.
Hva er tuning av GC-MS med EI-ionekilde?
er prosessen med å justere eller kalibrere et GC-MS system som bruker en EI ionekilde.
Tuning sikrer at MS funker optimalt. Her justeres spenning og strømmer for å effektivisere betingelser for ionisering, fragmentering Og så videre..
Tuning er forutsatt for å få korrekt info om m/z verdier og avstand mellom forbindelser.
Hva er bioanalyse?
Det er kvalitative og kvantitative analyser av endogene og exogene stoffer i biologisk materiale.
eks legemidler, LM metabolitter.
Hva er TDM og når brukes det?
Det er terapeutisk legemiddelovervåking og brukes for å monitorerer konsentrasjon av LM i blod for å sikre rett kons.
hvorfor?
- in case terapisvikt/toksisitet
- smalt terapautisk vindu
- sjekke bivirkninger v/høy kons.
- vurdere terapeutisk effekt
- compliance, se om pas tar riktig.
- metabolisme hos pas varierer.
Hva må man kjenne før man starter med TDM?
- biologisk halveringstid for LM
- må gå 5 halveringstider før første måling tas.
Hva tyder høyt forhold mellom serumkons av selve lm og metabolitt på?
- langsom lm omsetning
- nylig tatt lm
motsatt for lavt forhold.
Hva er forskjell på HPLC og GC/LC-MS?
HPLC –> har kun kromatogram.
GC/LC –> gir mer tilleggsinfo som gjør at den infoen er sikrere og rett identitet.
Forklar intern standard(IS)
det er en metode for kvantitativ analyse.
brukes ved kompliserte analyser
baserer seg på at en kjent mengde av et stoff tilsettes prøven så tidlig som mulig i analyseprosessen.
at en har kartlagt ratio for aral under IS-toppen med areal under analytt toppen.
fast mengde IS, analytt i ulike konsentrasjoner.
Hva er forutsetning for at IS følger analytt i alle trinn i prøveopparbeiding?
Må ha samme fysikalsk/kjemiske egenskaper. Da kanskje ikke helt lett å finne egnet IS.
Hva er unikt for MS med intern standard?
intern standard bruker samme forbindelse til intern standard som selve analytten
i intern standard er et antall C12 byttet ut med C13 eller så er et atall H1 byttet med H2. kan man skape en tydelig forskjell i masse mellom standarden og analytten
den får samme kjemiske egenskaper som analytt og vil følge analytt i alle reisetrinn før GC-MS analyse
IS og analytt får samme retensjonstid, men MS separer forbindelser med ulik m/z verdi.
Hva er forskjell på EI og ESI?
EI- brukes i GC-MS.
- Hard ioniseringsteknikk.
- EI bombarderer prøven som har blitt fordampet med elektroner.
- Kollisjon mellom elektroner og molekyler her gjør at molekyl mister et elektron og danner molekylion og danner fragmenter.
- VIKTIGSTE HER:
elektron blir revet av det nøytrale molekylet og danner et positivt ladet ion som vi kaller molekylion.
- denne prosessen kan overføre nok energi til molekylet at molekyl fragmenteres.
- Ionene føres så til MS.
i ESI:
- væske til gass
- ladde molekyler i dråper
- protonering og deprotonering.
