GC-MS

Question 1

hva er en GC-MS?

Answer 1

står for gass kromatografi-massespektrometri og er en analysemetode som kombinerer funksjonene til gasskromatografi og massespektrometri.

GC skiller og analyserer komponenter som kan fordampes uten å dekomponere. Prøver varmes og fordampes og føres gjennom en lang kolonne fult med et fast materiale (stasjonær fase) vha en gass som helium som mobil fase.

komponenter i prøven vil migrere gjennom kolonnen med ulik hastighet avhengig av kjemiske egenskaper og polaritet og separeres når de forlater kolonnen.

Question 1

Hva er MS?

Answer 1

Massespektrometri som er teknikk for å identifisere kjemiske komponenter på molekylært nivå basert på deres m/z.

prøven separeres i GC eller LC, ioniseres og føres inn til MS. Her brytes de ned til ioner og masse bestemmes.

Question 2

Hva kan man analysere i GC?

Answer 2

forbindelser som:
- vi kan få over i gassfase
- høy MW
- forbindelser med polare funksjonelle gr.
- kombinasjon høy MW og polare funksjonelle gr.
- å være termostabile forbindelser.

Question 3

kan man analysere forbindelser som er for polare til å analysere på GC?

Answer 3

Ja vha derivatisering gjør vi at den polare gr er mindre polar.
- etter derivatisering får forbindelsen høyere MW, men lar seg greit analysere på GC.

Question 4

nevn de to klassiske derivatiseringsteknikkene?

Answer 4

COOH omdannes til metylester, MW øker med 14 dalton

OH omdannes til TMS eter, MW øker med 72 Da for hver OH gruppe som derivatiseres.
TMS . eter ( trimetylsilyl)

Question 5

GC instrument hvordan fungerer den?

Answer 5

1. har mobilfase (carrier gas) som er inert gass som helium eller nitrogen og brukes til å transportere prøven gjennom kolonnen.
2. flow controller: for å kontrollere strømmen av carrier gas og sikrer t den er konstant gjennom analyseprosess.
3. injector port: prøven introduseres til systemet. prøven varmes og fordampes.
4. kolonne: rør er fylt med stasjonær fase der separasjon av komponenter finner sted. Temp styres nøye for for at komponenter kan eluere ulik tid.
5. detektor detekterer komponentene og identifiserer endringer.
6. recorder: lager et chromatogram. lager grafisk representasjon av detektorsignalet. hver topp representerer en komponent i prøven.

Question 6

Forklar injeksjon av prøve på GC?

Answer 6

Prøve løses i upolar organisk løsemiddel, som heksan.

mer komplisert enn LC.

Question 7

Hva ønsker vi med vår injektor?

Answer 7

måten vi injiserer på må ikke ødelegge kolonnens evne til å lage smale topper.

forholdet mellom ulike analytter i prøveløsningen må være den samme når de kommer inn i kolonnen.

Question 8

Hva er en splittløs injektor for GC motsetning til splittinjektor?

Answer 8

• mest vanligste å bruke.
• er noe som introduserer flytende prøve direkte inn i hele strømmen av bærergassen og deretter inn i kolonnen i motsetning til splittinjeksjon hvor kun en liten fraksjon av den injiserte prøven når kolonnen og resten blir ventet ut gjennom en splittventil.

basically –> splittløs injektor sørger for at hele prøvevolumetk blir overført til kolonnen.

Question 9

Hvordan fungerer en splitt og splittløs injektor?

Answer 9

1. sprøytenål stikkes gjennom rubber septum og nål går inn i liner.
2. trykk på stempel på sprøyta.
3. løsemiddel og analytter går spontant over i gassfase.
4. gassfase overføre stil kolonnen vha av bærergassen.

Question 10

Hvis volumenne i injektor er 1 ml vil det ta minst et min før alt av analytt og væsken den er løst i er overført til kolonnen. Går det bra?

Answer 10

Nei, den fraksjonen av en analytt som kommer først inn i kolonnen(ila noen sek) vil starte å vandre gjennom kolonnen. De molekylene som kommer sist, vil alltid være et min bak. Dvs at vi får topper minst 1 min brede. kolonnen har kun evnen til å lage topper som er 5-6sekunder brede i kapillarkolonner hos GC typisk.

Question 11

Hva er viktig med en kolonne?

Answer 11

At den bevarer sin evne til å lage smale topper.

ingen diskriminering mellom analytter(dvs at mengde forholdet mellom ulike analytter i løsningen er den samme når analyttene er kommet inn i kolonnen).

Question 12

Hva er grunnen til at analytter vandrer raskt eller langsom i en GC-kolonne?

Answer 12

temperatur i kolonnen er årsaken. ved lav temp sitter analyttmolekylene stille.

Question 13

Finnes to typer GC-kolonner:

Answer 13

kapillar kolonne:
- lange, tynne
- tyngt lag av stasjonær fase på innsiden av røret. stasjonærfase er det som gjør at forskjellige komponenter i prøven separeres basert på deres relative affinitet for denne fasen vs bærergassen.

Pakket kolonne:
- fysisk pakket stasjonær fase, ofte et fast materiale eller en væske på et solid bærermateriale. ofte kortere

Question 14

Hva er viktig i en kapillar kolonne i GC med mobil fase som bærergass?

Answer 14

At alle er inerte, dvs at ingen interaksjoner mellom bærergass og analytt forekommer. derfor ingen effekt på k´eller alfa.

eksempler er H2, He

Question 15

Hva er båndspredning i gasskromatografi?

Answer 15

det er når analyttmolekylets detektbare signal sprer seg over tid enn å forbli i et skarpt, veldefinert topp. skjer når analyttmolekyler ikke beveger seg gjennom kolonnen med nøyaktig samme hastighet, og gjør at de blir spredt utover og skaper en bredere topp.e

Question 16

Er båndspredning ønsket eller ikke?

Answer 16

Ikke ønsket fordi det reduserer oppløsning mellom ulike komponenter i en prøve og gjør det vanskeligere å identifisere og kvantifisere komponentene. Jo smalere topp jo bedre separasjon og oppløsning i kromatogrammet.

Question 17

Hvordan måles båndspredning?

Answer 17

ved å beregne antall teoretiske plater, N, som er et mål på kolonnens effektivitet. N i formen til Rs

Question 18

Hva er to fenomen som også kan gi båndspredning?

Answer 18

Longitudinal masseoverføring og masseoverføring i mobil fase.

Question 19

Hvilke tilfeller kan analytt ha høy og lav diffusjonshastigheten i GC?

Answer 19

analyttmolekyl diffunderer raskere med lette H2 molekyler rundt vs når det er tyngre molekyler som He rundt.

De med lette rundt seg reiser altså raskere gjennom kolonnen.

Dm(H2) > Dm(He)&raquo_space; Dm(N2)

Analyse tar lang tid med N2.

Question 20

Hva skjer i likningen med lav u og ved høy u (bærergasshastighet) i likning: H = A + Cl * Dm/u + Cm*u/Dm?

Answer 20

Lav u gir høy Dm og det skaper problemer.

Høy u gir problemer i andre litt hvor Dm ønskes stor. H2 er da bedre enn Hr. Begge er bedre enn N2.

Question 21

Hvorfor er riktig kolonne viktig?

Answer 21

For eksempel for bra separasjon, bra retensjonstid så ikke alle hoper seg opp, bra oppløsning.

Question 22

Hva sier alfa i den formelen i GC?

Answer 22

Refererer til selektiviteten eller relativ retensjonsfaktor som er et mål på hvor godt en kromatografisk kolonne kan skille mellom to komponenter.

Question 23

hvordan endre på alfa i GC formel?

Answer 23

• endre stasjonær fase med annen polaritet og funksjon, endre interaksjon mellom analytter og den stasjonære fasen som påvirker retensjonstiden.

endre temp, det påvirker fordampingshastigheten til analytt.

• endre bærer gass kan endre strømningshastigheten.
• endre kolonne diameter

Question 24

Hva må til for best mulig separasjoner vha av GC?

Answer 24

• Rett bærergass
• Rett bærergasshastightt
• Gode injeksjonsrutine
• Rett kolonne: passe tykk stasjonærfasefilm, rett stasjonærfase kjemi.
• Bra temp

Question 25

Hva gjør EI- ionekilden i en GC-MS?

Answer 25

Den lager ioner av nøytrale molekyler. Kan også bruke kjemisk ionisering.

Question 26

Hva er den mest vanligste ionekilden i GC-MS?

Answer 26

Det er EI - elektron ionisering.

Sendes strøm gjennom og varmer den opp, og da damper elektroner av.

Elektroner dras mot den positivt ladede anoden.

Når analytt molekyler kommer inn i strømmen av elektroner vil de bli ionisert og som ion sendes de videre inn i mS instrumentet.

vanlig reaksjon her er å få dannes M+ + 2e

Question 27

Hva skjer når et nøytralt molekyl kommer inn i GC-MS?

Answer 27

Når analytt er separert ledes den inn i MS og blir ionisert. Analytt vil miste et elektron som danner positivt ladde molekyl ioner.

De kan være ustabile og bryte ned til mindre fragmenter, som resulterer i fragmentioner med ulik m/z. Dette skjer fordi ionene får høy intern energi etter ionisering og det kan bryte bindinger.

passerer på kvadrupol og sorteres etter m/z.

hver topp i MS representerer hver topp i et ion med spesifikk m/z.

Question 28

Forklar begrep: Molekylion

Answer 28

Dette er ionet som representerer det intakte molekylet som har mistet et enkelt elektron under ioniseringsprosessen i MS.

Den har m/z-verdien lik molekylvekten av det opprinnelige nøytrale molekylet.

Question 29

Forklar begrep: Base peak

Answer 29

Det er det mest intese ionet i et MS, dvs det ionet som har den høyeste relative intensiteten.

Ofte et fragment ion.
Altså det høyeste i MS spekter

Question 30

Forklar begrep: fragmentioner

Answer 30

Ionene som dannes når molekylionet brytes ned til mindre stykker eller fragmenter. De har levere m/z verdier enn molekylionet og representerer ulike deler av det opprinnelige molekylet.

Hjelper med å bestemme struktur til opprinnelig molekyl basert på hvordan det brytes ned.

Basically fragmentioner

Question 31

Hvordan vite om vi har observert molekylionet M+? en metode

Answer 31

Velg høyeste m/z verdien.
om vi vet at molekylet inneholder et eller flere N –> bruk N regelen.
- 1 stk N, da betyr det at vi tror M+ er et oddetall.
- om høyeste m/z = 189 For eksempel så styrker det troen på at m/z = 189 er molekylionet.

Question 32

N - REGEL?

Answer 32

Antall N: 0, 2, 4, 6

Molekylion: partall

Fragmention: oddetall

Antall N: 1, 3, 4, 5, 6

Molekylion: oddetall

Fragmentioner: partall

Question 33

Gi annen måte å testefor om vi har observert molekylionet M+?

Answer 33

kan se på massedifferanse mellom kandidaten til M+, og massen til det første tonet med lavere masse.

Eks høyeste masse: 189, og nest er 130.

189-130 = 59

m/z= 59. det er naturlig tap.
Styrker at m/z c= 189 er M+. Må finne biter av organisk molekyl som veier 59 –> i tabell.

Tap av 59 er metylester.

Question 34

Hvorfor kunne identifisere M+?

Answer 34

Gir sikrere kvantitative analyser

mulighet til å beregne antall

C i molekyl og element sammensetning

sikrer identifisering av antatt kjent forbindelse.

Question 35

Hva er en CI ionekilde?

Answer 35

Referer til type ionekilde som er brukt i kjemisk ionisering.

enn å bombardere analyttmolekylene direkte med høyenergetiske elektroner som i EI, så introduseres reaktiv gass som metan eller ammoniakk. Den gassen ioniseres først, og resulterende ionene overføres så til et proton til analyttmolekylet for å danne (M+H)+.

Fordel her er at CI generer ioner på mykere måte og gir mindre fragmentering. Så MS er nklere å tolke. bra når analytt ikke tåler hard ionisering via EI.

Question 36

Hva er myk ionisering?

Answer 36

Det forekommer når man bruker CI ionekilder. Her skjer det da en mildere ionisering og ikke på like hard måte som EI.

Det gjør at vi kan overføre et molekyl fra nøytral til ionisert tilstand med minimal energitilførsel. Så molekyl blir ionisert uten å bryte opp i mange fragmenter. Myk ioniseringsmetode er viktig når man ønsker å bestemme moleyklvekten av intakte molekyler eller analyse forbindelse som lett kan dekomponere eller ikke tåler EI.

Question 37

Hva er tuning av GC-MS med EI-ionekilde?

Answer 37

er prosessen med å justere eller kalibrere et GC-MS system som bruker en EI ionekilde.

Tuning sikrer at MS funker optimalt. Her justeres spenning og strømmer for å effektivisere betingelser for ionisering, fragmentering Og så videre..

Tuning er forutsatt for å få korrekt info om m/z verdier og avstand mellom forbindelser.

Question 38

Hva er bioanalyse?

Answer 38

Det er kvalitative og kvantitative analyser av endogene og exogene stoffer i biologisk materiale.

eks legemidler, LM metabolitter.

Question 39

Hva er TDM og når brukes det?

Answer 39

Det er terapeutisk legemiddelovervåking og brukes for å monitorerer konsentrasjon av LM i blod for å sikre rett kons.

hvorfor?
- in case terapisvikt/toksisitet
- smalt terapautisk vindu
- sjekke bivirkninger v/høy kons.
- vurdere terapeutisk effekt
- compliance, se om pas tar riktig.
- metabolisme hos pas varierer.

Question 40

Hva må man kjenne før man starter med TDM?

Answer 40

• biologisk halveringstid for LM
• må gå 5 halveringstider før første måling tas.

Question 41

Hva tyder høyt forhold mellom serumkons av selve lm og metabolitt på?

Answer 41

• langsom lm omsetning
• nylig tatt lm

motsatt for lavt forhold.

Question 42

Hva er forskjell på HPLC og GC/LC-MS?

Answer 42

HPLC –> har kun kromatogram.

GC/LC –> gir mer tilleggsinfo som gjør at den infoen er sikrere og rett identitet.

Question 43

Forklar intern standard(IS)

Answer 43

det er en metode for kvantitativ analyse.

brukes ved kompliserte analyser

baserer seg på at en kjent mengde av et stoff tilsettes prøven så tidlig som mulig i analyseprosessen.

at en har kartlagt ratio for aral under IS-toppen med areal under analytt toppen.

fast mengde IS, analytt i ulike konsentrasjoner.

Question 44

Hva er forutsetning for at IS følger analytt i alle trinn i prøveopparbeiding?

Answer 44

Må ha samme fysikalsk/kjemiske egenskaper. Da kanskje ikke helt lett å finne egnet IS.

Question 45

Hva er unikt for MS med intern standard?

Answer 45

intern standard bruker samme forbindelse til intern standard som selve analytten

i intern standard er et antall C12 byttet ut med C13 eller så er et atall H1 byttet med H2. kan man skape en tydelig forskjell i masse mellom standarden og analytten

den får samme kjemiske egenskaper som analytt og vil følge analytt i alle reisetrinn før GC-MS analyse

IS og analytt får samme retensjonstid, men MS separer forbindelser med ulik m/z verdi.

Question 46

Hva er forskjell på EI og ESI?

Answer 46

EI- brukes i GC-MS.
- Hard ioniseringsteknikk.
- EI bombarderer prøven som har blitt fordampet med elektroner.
- Kollisjon mellom elektroner og molekyler her gjør at molekyl mister et elektron og danner molekylion og danner fragmenter.
- VIKTIGSTE HER:
elektron blir revet av det nøytrale molekylet og danner et positivt ladet ion som vi kaller molekylion.

• denne prosessen kan overføre nok energi til molekylet at molekyl fragmenteres.
• Ionene føres så til MS.

i ESI:
- væske til gass
- ladde molekyler i dråper
- protonering og deprotonering.