Klonierungsstrategien Flashcards
Nenne drei Definitionen des Begriffs “Klone”.
- Klone sind genetisch identische Nachkommen.
- Klone sind Aggregate/Kulturen von genetisch identischen Zellen, die sich von einer Einzelzelle ableiten.
- Klone sind Pflanzen oder Tiere, die die identischen Gene tragen, wie der Organismus, von dem sie sich ableiten.
Beschreibe das allgemeine Schema einer Klonierung.
- Isolierung eines Plasmids aus einer lebenden Zelle
- Aufschneiden des Plasmids an einem spezifischen Punkt mit Hilfe von Enzymen
- Isolierung der DNA, die das Gene of interest (GOI) enhält
- Das GOI wird aus der DNA mit Hilfe von Enzymen herausgeschnitten
- Das GOI wird in die Lücke im Plasmid eingesetzt
- Durch Ligase werden die Brüche zwischen Plasmid und GOI geschlossen.
Was sind Vektoren?
Vektoren sind modifizierte DNAs (manchmal auch RNAs) aus Baktrerien oder Viren. Häufig handelt es sich bei Vektoren um Derivate natürlicher Plasmide.
Wie wird die zu klonierende Nukleinsäure noch genannt?
Sie wird auch Target oder GOI (gene of interest) genannt.
Aus welchen Zellen kann die Target-DNA entnommen werden?
Sie kann aus Eukaryonten, Prokaryonten oder Viren stammen.
Nenne und erkläre in sechs Schritten das Prinzip der Gen-Klonierung.
- Präparation der Target-DNA
- Präparation der Vektor-DNA
- Rekombination von Vektor- und Target-DNA unter Verwendung von Ligasen, Topoisomerasen und PCR-Techniken
- Vermehrung der rekombinanten DNA durch Infektion / Transfektion von Wirtszellen
- Identifizierung von Klonen, die rekombinante Vektoren tragen
- Charakterisierung der Klone durch Sequenzierung.
Nenne zehn Anwendungen von Gen-Klonierung.
- Subklonierung: Wechsel eines Vektors
- Subklonierung: Selektion von Subfragmenten für Experimente
- Klonierung für Sequenzanalysen
- Genbänke
a) Vollständige,
genomische DNA-Genbank
b) Partielle genomische DNA-Genbank
c) Vollständige cDNA-Genbank - Klonierung mit dem Ziel der Proteinexpression/-Produktion
- Klonierung mit dem Ziel der Funktionsanalyse
- Klonierung für Mutagenese-Experimente
- Herstellen knock out-, knock in- oder knock down-Strukturen (siRNA, shRNA, CRISPER-Cas9) in eukaryotischen Zellen
- Herstellung genetisch veränderter Pflanzen oder Tiere
- Herstellung von Vektoren für die Gentherapie
Nenne drei Bestandteile eines Plasmidvektors.
- ORI: Startpunkt der Replikation
- Selektionsmarker: Erlaubt die Selektion auf transfizierte Bakterien
- Polylinker: Enthält eine Abfolge von Schnittstellen für Restriktionsenzyme
Warum müssen natürliche Plasmide für die Klonierung modifiziert werden?
Natürlich Plasmide enthalten auch außerhalb des Polylinkers Schnittstellen für Restriktionsenzyme. Da die Plasmide während der Klonierung jedoch nicht willkürlich geschnitten werden dürfen, müssen die Bereiche mit den ungewollten Schnittstellen entfernt werden.
Welcher Schritt der Klonierung bedingt die Klonierungskapazität?
Die Klonierungskapazität wird durch die Methode des Einbringens des rekombinanten Vektors in die Wirtszelle bedingt.
Wie wird die Klonierungskapazität definiert?
Die Klonierungskapazität gibt die möglichen Längen des GOIs an.
Nenne die fünf Vektortypen.
- Plasmide
- Lambda-Phagen (ds DNA)
- Einzelstrang-Phagen (ss DNA)
- Derivate von tier- und/oder pflanzen-pathogenen Viren
-> z.B. Adenoviren, Retroviren oder Lentiviren - Hefe-Vektoren (ds DNA)
-> z.B. YACs
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von Phagen?
Bei Phagen liegt die Klonierungskapazität etwa bei 20.000 bp. Sie ist damit deutlich höher als bei Plasmiden.
Was sind Plasmide ?
Plasmide sind extra-chromosomale, zirkuläre DNA-Moleküle, die in Bakterienzellen autonom repliziert werden.
Welche Funktionen haben Plasmide in Bakterien?
- Sie verleihen Bakterien Resistenzen.
- Sie ermöglichen den Genomaustausch (F-Plasmid)
Nenne zwei essentielle Bestandteile von artifiziellen Laborplasmiden.
- ORI: origin of replication
- MCSs: multiple cloning sites
Nenne zwei Plasmid-Gruppen, die zur (Sub-)Klonierung von DNA oder cDNA genutzt werden.
- pUC-Plasmid-Familie
- pTOPO-Vektoren (TA-cloning)
Nenne zwei Plasmid-Gruppen, die für die Expression und Reinigung von Fusionsproteinen genutzt werden und beschreibe kurz ihre Funktion.
- pET
-> Expression von Fusionsproteinen mit His-Tag; Reinigung solcher Proteine mittels Säulenchromatographie - pGEX
-> Expression von Fusionsproteinen mit GST-Tag; Reinigung solcher Proteine durch Pull-down-Studien
Nenne die vier gängigsten Tags von Fusionsproteinen.
- His-Tag (6 Histidinreste)
- GST-Tag (Enzym-Tag)
- GFP-Tag (Fluoreszierendes Tag)
- FLAG-Tag (Phagen-Peptid)
Nenne zwei Restriktionsenzyme.
- BamHI
- EcoRI
Erkläre in sieben Schritten das Prinzip des GST-pull downs.
- GST-Fusionsprotein wird in Bakterien expremiert
- Bakterien werden lysiert und Lysat wird auf Glutathion-Sepharose-beads gegeben
- Das GST-Fusionsprotein bindet kovalent an die beads und die ungebundenen Proteine werden ausgewaschen
- Das Rohlysat, das den interagierenden Proteinpartner enthält, wird zu den beads gegeben
- Das Fusionsprotein interagiert mit seinem Partner und die restlichen Proteine werden ausgewaschen
- Der gebundene Proteinkomplex wird durch Zugabe von Glutathionen vom bead eluiert
- Der Proteinkomplex wird unter Hitze denaturiert, die Bestandteile werden in der Gelelektropherese separiert und im Western Blot analysiert
Beschreibe kurz die wichtigsten Eigenschaften von Phagen.
- Sie sind Derivate von Lambda-Phagen
- Sie enthalten ein ORI und cos-sites
- Ein großer Teil ihrer DNA kann durch Fremd-DNA ersetzt werden, ohne ihre Vermehrungsfähigkeit zu beeinflussen
- Fremd-DNA wird in-vitro verpackt und vermehrt
- Phagen eignen sich zur Erstellung von Genbänken
Beschreibe kurz die wichtigsten Eigenschaften von Cosmiden.
- Cosmide sind extrachromosomale, zirkuläre DNA-Moleküle
- Sie enthalten ein ORI, Selektionsmarker und cos-sites
- Sie können in-vitro in Phagenköpfe verpackt werden, weshalb zu kurze oder zu lange Nukleinsäuren ungeeignet sind
- Sie vermehren sich in Bakterien als Plasmid
- Cosmide eignen sich zur Erstellung von Genbänken
Nenne Unterschiede und Gemeinsamkeiten von Phagen- und Cosmid-Vektoren.
- Gemeinsamkeiten:
- In-vitro packaging
- Infektion als Phage - Unterschiede:
- Bei Phagen-Vektoren sind die rekombinanten Klone Phagen, die die Wirtsbakterien lysieren
- Bei Cosmid-Vektoren sind die rekombinanten Klone Bakterien; es können keine weiteren Phagen entstehen
Nenne die Bestandteile einer Lambda-Phage.
- Lineare ds DNA, deren Enden cos-sites tragen, die zum Ringschluss führen können
- Kapsid-Proteine
- Verpackungs-Proteine
- Schwanz-Proteine
- Regulatoren von Lysogenie
Beschreibe in vier Schritten das In-vivo-packaging von Lambda-Phagen-DNA.
- Die Terminase bindet das virale Genom.
- Die Terminase-gebundene DNA bindet an das Portal-Protein des Phagenköpfchens.
- Die virale DNA wird unter ATP-Verbrauch ins Phagenköpfchen transportiert.
- Sobald das Phagenköpfchen voll ist, wird die übrige DNA an der nächsten cos-site abgetrennt.
Nenne die fünf Schritte des lytischen Zyklus.
- Anlagerung der Phage an der Wirtszelle
- Injektion der Phagen-DNA
- Replikation der Phagen-DNA in der Wirtszelle
- Phagenproduktion in der Wirtszelle
- Lyse der Wirtszelle und Freisetzung der neuen Phagen
Beschreibe in drei Schritten den lysogenen Zyklus.
- Nach der Injektion der Phagen-DNA in die Wirtszelle wird diese in das Wirtsgenom integriert (Prophage)
- Während der Zellteilung wird das rekombinante Genom repliziert, es folgt eine infizierte Bakterienpopulation
- Die Phagen-DNA kann durch äußere Einflüsse oder spontan aus dem Chromosom herausgeschnitten werden, wodurch das Bakterium in den lytischen Zyklus wechselt
Wird in Klonierungslaboren der lytische oder der lysogene Zyklus bevorzugt. Begründe deine Antwort.
Im Labor wird je nach Ziel einer der beiden Zyklen unterdrückt.
Meist wird jedoch der lytische Zyklus bevorzugt, um Phagen mit spezifischer DNA zu isolieren.
Wie wird in Klonierungslaboren der lysogene Zyklus der Bakterien unterdrückt ?
Im Phagen-Genom werden die Lysogenie-Gene durch die Target-DNA ersetzt. Die infizierten Bakterien schlagen dadurch immer den lytischen Weg ein.
Was sind Concatamere ?
Concatamere sind DNA-Multimere. Die langen Ketten aus sich wiederholenden Genomen sind das Substrat fürs in-vivo-packaging.
In-vitro kann man Concatamere über ein Annealing der cos-sites erhalten.
Erkläre das Replikationsprinzip “rolling circle”.
- In einem zyklischen ds DNA-Molekül wir einer der Stränge an einem spezifischen Punkt geöffnet.
- Der geöffnete Strang wird am 3´-Ende verlängert, wobei der geschlossene Strang als Matrize dient.
- Durch das “Abrollen” der zyklischen Matritze eintsteht laufend ein neuer einzelner DNA-Strang.
- Der Einzelstrang wird durch die Synthese von Okazakifragmenten zum Doppelstrang erweitert.
Wodurch wird bei Klonierungen mit in-vitro-packaging die Klonierungskapazität limitiert ?
Durch die Größe der Phagenköpfchen
Nenne die fünf wichtigsten Bestandteile eines YACs (yeast artificial chromosome).
- Centromer-Region
- Telomere
- ORI
- Prokaryotische Resistenzgene
- Hefe-spezifische Selektionsmarker
Wie vermehren sich YACs ?
Sie werden in Bakterien während der Mitose auf die Tochterzellen aufgeteilt, was jedoch nur funktioniert, wenn die Insertionen lang genug sind
Was sind BACs und aus welchen Bestandteilen bestehen sie ?
BACs sind “bacterial artificial chromosomes”, die auf bakteriellen Mini-F-Plasmiden basieren.
Zu ihren Bestandteilen gehören:
1. ORI
2. Selektionsmarker
3. Regulatorische Sequenzen
Werden Viren als Klonierungsvektoren genutzt, werden sie zuvor in ihrer Funktion eingeschränkt. Was umfasst diese Einschränkungen ?
Den Viren wird ihre Replikationsfähigkeit genommen. Sie können Zielzellen infizieren, besitzen aber
-> keine genetische Information zur Bildung von Kapsidproteinen
-> keine Information für die Glykoproteine des Envelops
-> keine Information für die Proteine der Vermehrung des Virusgenoms
Welche beiden Viren-Typen werden bevorzugt für die Klonierung eingesetzt ?
- Gamma-Retroviren
- Lentiviren
Nenne drei Anwendungen von Viren als Klonierungsvektoren.
- Einbringen von Vektoren zur RNA-Interferenz (siRNA, shRNA)
- Herstellung von iPS-Zellen
- Einbringen von Komponenten des CRISPR-Cas9-Systems
Wie werden die replikationsdefizienten Viren für die Klonierung hergestellt ?
Die Viren werden in HEK293T-Zellen produziert. Dazu wird die Vektor-DNA zusammen mit den Verpackungsplasmiden in HEK-Zellen transfiziert. Die Verpackungsplasmide erlauben die Herstellung der infektiösen, rekombinanten Viruspartikel, aber die DNA der Verpackungsplasmide werden nicht mit in die Viruspartikel verpackt.
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von Plasmiden ?
0,1 - 10 kb
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von Lambda-Phagen ?
-> 15-20kb bei einem vollständig ausgetauschten Vektoren
-> 0,1-5 kb bei einem zusätzlich integriertem Vektor
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von Cosmiden ?
35 - 45 kb
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von Bakteriophagen P1 ?
80-100 kb
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von BACs ?
50 - 300 kb
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von YACs ?
100 - 2000 kb
Wie hoch ist die Klonierungskapazität von menschlichen AC ?
> 2000 kb
Können virale Genome in die chromosomale DNA einer Wirtszelle integriert werden ?
Ja, die Integration ist möglich, aber nur bedingt erwünscht.
-> In stabil veränderten Zellen ( z.B. in der Gentherapie) ist die Integration erwünscht
-> Bei Experimenten zum Einbringen des CRISPR-Cas9-Systems ist die Integration meist unerwünscht
Nenne die sechs Schritte einer Expressionsklonierung.
- Restriktion des Expressions-Vektors
- Isolierung und Restriktion der Ziel-DNA
- Ligase-Reaktion (Leseraster muss stimmen)
- Transfektion der transfektionskompetenten Expressionsstämme und Selektion auf GVO
- Induktion der Expression -> Bakterien werden pelletiert
- Proteine aus Bakterien gewinnen, SDS-Page, Färbung und Reinigung der Proteine
Was sind Restriktions-Endonukleasen Typ II ?
Es sind DNA-schneidende Enzyme, bei denen die Erkennungsstelle gleich der Schnittstelle ist.
Was sind “sticky ends” und “blunt ends” ?
Beides sind Ende von Doppelsträngiger DNA. Bei “blunt ends” enden beide DNA-Einzelstränge nach demselben Basepaar. bei “sticky ends” hat einer der beiden Einzelstränge einen Überhang von einigen Basen.
Welchen Vorteil bietet es Vektor- und Target-DNA mit dem gleichen Restriktionsenzym zu schneiden ?
Es entstehen dadurch zueinander passende sticky ends oder blunt ends, was die Integration der Target DNA in den Vektor erleichtert.
Nenne drei Gruppen von Restriktionsenzymen Typ II.
- 4-base cutter
- 6-base cutter
- 8-base cutter
Nenne zwei Short-cut-Verfahren bei Klonierungen.
- TA-cloning
- GATEWAY Technologie
Beschreibe in drei Schritten, wie TOPO-TA-cloning funktioniert.
- Es wird ein PCR-Produkt mit einem A-Rest-Überhang produziert
- Der Vektor hat einen T-Rest-Überhang, an den kovalent Topoisomerase I gebunden ist
- Die Topoisomerase I ligiert die DNA-Fragmente und wird danach freigesetzt
Beschreibe kurz das Prinzip der GATEWAY-Technologie.
-> Vektor 1 enthält die attB-Region
-> Vektor 2 enthält die attP-Region
-> In Bakterien, die die Integrationsfaktoren (Enzyme) exprimieren, kann die Rekombination erfolgen
-> Alternativ kann der Enzym-Mix in-vitro zu den Vektoren gegeben werden
-> Es kommt zur Umklonierung vom “donor vector” zum “entry vector” und dann weiter zum “destination vector”
Beschreibe in sieben Schritten den Ablauf einer typischen cDNA-Klonierung.
- Restriktion des Vektors (Plasmid oder Phage)
- Isolierung und Reinigung von mRNA
- Herstellung der cDNA mittels reverser Transkriptase
- Transfektion der Wirtsorganismen
- Wachstum der Transfomanden unter Selektionsbedingungen
- Identifizierung der Rekombinanten
- Analyse durch Sequenzierung
Nenne fünf Beispiele von Selektionsmethoden bei klonierten Zellen.
- Antibiotika / Test auf Resistenzen
- LacZ-Expression / Blau-Weiß-Selektion
- Lethale Gene (häufig für eukaryotische Systeme)
- Mangel-Medien (häufig für Hefezellen)
- Screening mittelts PCR
Nenne vier Werkzeuge für eine typische Klonierung.
-> Typ II Restriktionsenzyme
-> Ligasen
-> PCR-Technologien
-> Reverse Transkriptase
Aus welchem Organismus stammt die für Klonierungen genutzte Reverse Transkriptase ?
Retrovirus
Welche Enzymaktivitäten enthält die Reverse Transkriptase ?
-> RNA-abhängige DNA-Polymerase
-> DNA-abhängige DNA-Polymerase
-> RNase H
-> Integrase
Wie werden Lentiviren für das Einbringen der Komponenten des CRISPR-Cas9-Systems hergestellt ?
-> Viren werden in HEK293T Zellen produziert
-> Rekombinante Vektor-DNA wird zusammen mit den Verpackungsplasmiden in HEK-Zellen transfiziert
-> Lentiviren sind replikationsdefizient
