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Molekularbiologie > Bakterielles Abwehrsystem CRISPR/Cas > Flashcards

Bakterielles Abwehrsystem CRISPR/Cas Flashcards

1
Q

Aus welchen beiden Komponenten besteht das CRISPR/Cas-System ?

A
  1. CRISPR array:
    -> Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats
    -> Abschnitte sich wiederholender DNA im Genom von Bakterien
  2. cas-Gene:
    -> Kodieren für eine große heterogene Gruppe an Proteinen, die an der Abwehr beteiligt sind
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2
Q

Nenne drei Funktionen des CRISPR/Cas-Systems.

A

-> Verteidigung gegen Fremd-DNA

-> Adaptive und Vererbbare Immunität

-> Resistenz gegenüber des Eindringens von Fremd-DNA

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3
Q

Wie viele CRISPR-Arrays sind im Genom durchschnittlich zu finden ?

A

-> Drei in Bakterien
-> Fünf in Archaeen

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4
Q

Nenne und beschreibe die beiden Bestandteile des CRISPR-Arrays.

A
  1. Repeats:
    -> 20-50bp lang
    -> Pro CRISPR-Lokus kommen 2 bis mehrere 100 repeats vor
    -> Oft palindromisch
  2. Spacers:
    -> 20-70bp lang
    -> Trennen die repeats voneinander
    -> Entstammen der DNA von Viren oder Plasmiden
    -> Haben eine hypervariable Sequenz
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5
Q

Was ist der Leader, der vor dem CRISPR-Array positioniert ist ?

A

-> Enthält den Promotor zur Transkription des CRISPR-Lokus

-> ist 100-500bp lang

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6
Q

Was sind Protospacer, Pre-Spacer und PAM im Kontext des CRISPR-Arrays ?

A
  1. Protospacer:
    -> Sequenzabschnitt der Fremd-DNA
    -> Wird als verkürzte, prozessierte DNA als Spacer im CRISPR-Array eingebaut
  2. PAM:
    -> 2-5nt lange Sequenz, die den Protospacer flankiert
    -> Protospacer wird durch Erkennung der PAM selektiert
  3. Pre-Spacer:
    -> Sequenz der Fremd-DNA, die PAM und Proto-Spacer enthält
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7
Q

Was sind die Cas-Gene ?

A

-> 3-10 Cas-Gene bilden ein Cas-Operon

-> Cas-Operon liegt vor dem Leader des CRISPR-Arrays

-> Cas-Proteine sind z.B. Helikasen, Nukleasen und Polymerasen

-> Cas-Gene sind bezüglich Anordnung, Orientierung und Anzahl sehr variabel

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8
Q

CRISPR/Cas-Systeme lassen sich in zwei Klassen unterteilen. Für was für Proteine kodieren die Cas-Gene der Klassen und welche Klasse kommt in welchen Organismen vor ?

A
  1. Klasse 1:
    -> Kodierung für multiple Proteine
    -> Sind in 90% der CRISPR-Loci in Bakterien und Archaeen zu finden
  2. Klasse 2:
    -> Kodierung für einzelne Effektor-Proteine
    -> Sind in 10% der CRISPR-Loci ausschließlich in Bakterien zu finden
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9
Q

Nenne und erkläre die drei Phasen, die der Mechanismus des CRISPR/Cas-Systems durchläuft.

A
  1. Adaption (Akquisition, Immunisierung):
    -> Erkennung der Fremd-DNA nach Erstinfektion
    -> Fragmentierung der Fremd-DNA
    -> Einbau in CRISPR-Lokus als neuer Spacer
  2. Expression und Prozessierung:
    -> Transkription des CRISPR-Arrays zur pre-crRNA
    -> Prozessierung zu crRNA
  3. Interferenz:
    -> Spezifische Erkennung und Abbau der Fremd-DNA durch einen Komplex aus Cas-Proteinen und crRNA
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10
Q

An welcher Position im CRISPR-Array werden neue Spacer eingebaut ?

A

-> Das am Leader-Ende liegende repeat wird gespalten

-> Der neue Spacer wird innerhalb des repeats integriert

-> Jeweils fehlende repeat-Sequenz wird aufgefüllt

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11
Q

Beschreibe die Prozessierung von Pre-crRNA Typ 1.

A

-> Jedes repeat enthält einen hairpin

-> Endoribonuklease Cas6 spaltet am 3´-Ende jedes hairpins

-> 3´-Ende bleibt mit Cas6 assoziiert

-> crRNA besteht am 5´-Ende aus repeat-RNA, am 3´-Ende aus repeat-RNA mit hairpin und dazwischen liegt der Spacer

-> 5´-Ende ist wichtig für Positionierung im Überwachungskomplex

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12
Q

Beschreibe die Prozessierung von Pre-crRNA Typ 2.

A

-> tracrRNA bindet an repeats des CRISPR-Arrays

-> Cas9/RNase III spalten die Doppelstrang-Region

-> 5´-repeat-Sequenz wird beim Trimming durch eine unbekannte Ribonuklease entfernt

-> crRNA besteht am 5´-Ende aus dem Spacer und am 3´-Ende aus repeat-RNA gepaart mit tracrRNA

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13
Q

Was ist tracrRNA ?

A

-> Transactivating crRNA
-> 25nt lang
-> Komplementär zur repeat-Sequenz der crRNA

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14
Q

Aus welchen Bestandteilen ist der Cascade Typ I-E Komplex aufgebaut ?

A

-> Cas6e
-> Cse2
-> Cas7
-> Cas5
-> Cas8
-> crRNA

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15
Q

Aus wie vielen Untereinheiten besteht der Cascade Typ I-E Komplex ?

A

11

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16
Q

Aus welchen Bestandteilen ist der Cas9 Typ II Komplex aufgebaut ?

A

-> crRNA
->tracrRNA
-> Cas9-Protein

17
Q

Um was für ein Enzym handelt es sich bei Cas9 ?

A

Endoribonuklease

18
Q

Nenne die sechs Schritte der CRISPR-Cas Typ I - vermittelten DNA-Interferenz.

A
  1. Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab
  2. Cas8 erkennt und bindet PAM der Target-DNA
  3. Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz und der Target-DNA
  4. Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer-Sequenz der Target-DNA führt zur Bildung eines R-Loops
  5. Rekrutierung von Cas3
  6. Cas3-vermittelte DNA-Degradation
19
Q

Nenne die sechs Schritte der CRISPR-Cas Typ II - vermittelten DNA-Interferenz.

A
  1. Cas9-crRNA/tracrRNA-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab
  2. Erkennung der PAM-Sequenz durch Cas9
  3. Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz und der Target DNA
  4. Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer-Sequenz der Target-DNA führt zur Bildung eines R-Loops
  5. Cas9 spaltet die dsDNA 3 bp upstream von PAM, wobei blunt ends generiert werden
  6. DNA-Degradation durch weitere DNasen
20
Q

Inwiefern unterscheidet sich die Lage der PAM-Sequenz bei CRISPR-Cas-vermittelter DNA-Interferenz von Typ I zu Typ II ?

A
  1. Typ I:
    -> PAM liegt auf dem Target-Strang
    -> Target-Strang ist zur crRNA komplementär
  2. Typ II:
    -> PAM liegt auf dem Non-Target-Strang
    -> Non-Target-Strang ist nicht komplementär zur crRNA
21
Q

Nenne vier Anwendungsmöglichkeiten des CRISPR/Cas-Systems.

A

-> Einbringen von Phagen-Resistenzen in industriell bedeutsame Bakterien

-> Identifizierung pathogener Bakterienstämme

-> Knockdown von endogenen Genen durch Transformation Plasmid-kodierter spezifischer CRISPR-Sequenzen

-> Genome-Editing in Eukaryonten

22
Q

Was versteht man im Kontext des CRISPR/Cas9-vermittelten Genome-Editings unter Guide RNA ?

A

-> Fusion aus crRNA und tracrRNA

23
Q

Was versteht man im Kontext des CRISPR/Cas9-vermittelten Genome-Editings unter Indels ?

A

-> Deletionen und Insertionen

-> Indels führen zum Funktionsverlust des Genproduktes

-> Indels sind das Ergebnis des Genome-Editings

24
Q

Wie viele Endonukleasen-Domänen enthält Cas9 ?

A

-> 2
-> Eine pro Einzelstrang der dsDNA

25
Q

Beim Genome-Editing entstehen Doppelstrangbrüche. Wie werden diese repariert ?

A

-> Durch Nicht-homologe Endverknüpfung

-> Durch homologe Reparatur

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