Bakterielles Abwehrsystem CRISPR/Cas Flashcards
Aus welchen beiden Komponenten besteht das CRISPR/Cas-System ?
- CRISPR array:
-> Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats
-> Abschnitte sich wiederholender DNA im Genom von Bakterien - cas-Gene:
-> Kodieren für eine große heterogene Gruppe an Proteinen, die an der Abwehr beteiligt sind
Nenne drei Funktionen des CRISPR/Cas-Systems.
-> Verteidigung gegen Fremd-DNA
-> Adaptive und Vererbbare Immunität
-> Resistenz gegenüber des Eindringens von Fremd-DNA
Wie viele CRISPR-Arrays sind im Genom durchschnittlich zu finden ?
-> Drei in Bakterien
-> Fünf in Archaeen
Nenne und beschreibe die beiden Bestandteile des CRISPR-Arrays.
- Repeats:
-> 20-50bp lang
-> Pro CRISPR-Lokus kommen 2 bis mehrere 100 repeats vor
-> Oft palindromisch - Spacers:
-> 20-70bp lang
-> Trennen die repeats voneinander
-> Entstammen der DNA von Viren oder Plasmiden
-> Haben eine hypervariable Sequenz
Was ist der Leader, der vor dem CRISPR-Array positioniert ist ?
-> Enthält den Promotor zur Transkription des CRISPR-Lokus
-> ist 100-500bp lang
Was sind Protospacer, Pre-Spacer und PAM im Kontext des CRISPR-Arrays ?
- Protospacer:
-> Sequenzabschnitt der Fremd-DNA
-> Wird als verkürzte, prozessierte DNA als Spacer im CRISPR-Array eingebaut - PAM:
-> 2-5nt lange Sequenz, die den Protospacer flankiert
-> Protospacer wird durch Erkennung der PAM selektiert - Pre-Spacer:
-> Sequenz der Fremd-DNA, die PAM und Proto-Spacer enthält
Was sind die Cas-Gene ?
-> 3-10 Cas-Gene bilden ein Cas-Operon
-> Cas-Operon liegt vor dem Leader des CRISPR-Arrays
-> Cas-Proteine sind z.B. Helikasen, Nukleasen und Polymerasen
-> Cas-Gene sind bezüglich Anordnung, Orientierung und Anzahl sehr variabel
CRISPR/Cas-Systeme lassen sich in zwei Klassen unterteilen. Für was für Proteine kodieren die Cas-Gene der Klassen und welche Klasse kommt in welchen Organismen vor ?
- Klasse 1:
-> Kodierung für multiple Proteine
-> Sind in 90% der CRISPR-Loci in Bakterien und Archaeen zu finden - Klasse 2:
-> Kodierung für einzelne Effektor-Proteine
-> Sind in 10% der CRISPR-Loci ausschließlich in Bakterien zu finden
Nenne und erkläre die drei Phasen, die der Mechanismus des CRISPR/Cas-Systems durchläuft.
- Adaption (Akquisition, Immunisierung):
-> Erkennung der Fremd-DNA nach Erstinfektion
-> Fragmentierung der Fremd-DNA
-> Einbau in CRISPR-Lokus als neuer Spacer - Expression und Prozessierung:
-> Transkription des CRISPR-Arrays zur pre-crRNA
-> Prozessierung zu crRNA - Interferenz:
-> Spezifische Erkennung und Abbau der Fremd-DNA durch einen Komplex aus Cas-Proteinen und crRNA
An welcher Position im CRISPR-Array werden neue Spacer eingebaut ?
-> Das am Leader-Ende liegende repeat wird gespalten
-> Der neue Spacer wird innerhalb des repeats integriert
-> Jeweils fehlende repeat-Sequenz wird aufgefüllt
Beschreibe die Prozessierung von Pre-crRNA Typ 1.
-> Jedes repeat enthält einen hairpin
-> Endoribonuklease Cas6 spaltet am 3´-Ende jedes hairpins
-> 3´-Ende bleibt mit Cas6 assoziiert
-> crRNA besteht am 5´-Ende aus repeat-RNA, am 3´-Ende aus repeat-RNA mit hairpin und dazwischen liegt der Spacer
-> 5´-Ende ist wichtig für Positionierung im Überwachungskomplex
Beschreibe die Prozessierung von Pre-crRNA Typ 2.
-> tracrRNA bindet an repeats des CRISPR-Arrays
-> Cas9/RNase III spalten die Doppelstrang-Region
-> 5´-repeat-Sequenz wird beim Trimming durch eine unbekannte Ribonuklease entfernt
-> crRNA besteht am 5´-Ende aus dem Spacer und am 3´-Ende aus repeat-RNA gepaart mit tracrRNA
Was ist tracrRNA ?
-> Transactivating crRNA
-> 25nt lang
-> Komplementär zur repeat-Sequenz der crRNA
Aus welchen Bestandteilen ist der Cascade Typ I-E Komplex aufgebaut ?
-> Cas6e
-> Cse2
-> Cas7
-> Cas5
-> Cas8
-> crRNA
Aus wie vielen Untereinheiten besteht der Cascade Typ I-E Komplex ?
11
Aus welchen Bestandteilen ist der Cas9 Typ II Komplex aufgebaut ?
-> crRNA
->tracrRNA
-> Cas9-Protein
Um was für ein Enzym handelt es sich bei Cas9 ?
Endoribonuklease
Nenne die sechs Schritte der CRISPR-Cas Typ I - vermittelten DNA-Interferenz.
- Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab
- Cas8 erkennt und bindet PAM der Target-DNA
- Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz und der Target-DNA
- Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer-Sequenz der Target-DNA führt zur Bildung eines R-Loops
- Rekrutierung von Cas3
- Cas3-vermittelte DNA-Degradation
Nenne die sechs Schritte der CRISPR-Cas Typ II - vermittelten DNA-Interferenz.
- Cas9-crRNA/tracrRNA-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab
- Erkennung der PAM-Sequenz durch Cas9
- Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz und der Target DNA
- Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer-Sequenz der Target-DNA führt zur Bildung eines R-Loops
- Cas9 spaltet die dsDNA 3 bp upstream von PAM, wobei blunt ends generiert werden
- DNA-Degradation durch weitere DNasen
Inwiefern unterscheidet sich die Lage der PAM-Sequenz bei CRISPR-Cas-vermittelter DNA-Interferenz von Typ I zu Typ II ?
- Typ I:
-> PAM liegt auf dem Target-Strang
-> Target-Strang ist zur crRNA komplementär - Typ II:
-> PAM liegt auf dem Non-Target-Strang
-> Non-Target-Strang ist nicht komplementär zur crRNA
Nenne vier Anwendungsmöglichkeiten des CRISPR/Cas-Systems.
-> Einbringen von Phagen-Resistenzen in industriell bedeutsame Bakterien
-> Identifizierung pathogener Bakterienstämme
-> Knockdown von endogenen Genen durch Transformation Plasmid-kodierter spezifischer CRISPR-Sequenzen
-> Genome-Editing in Eukaryonten
Was versteht man im Kontext des CRISPR/Cas9-vermittelten Genome-Editings unter Guide RNA ?
-> Fusion aus crRNA und tracrRNA
Was versteht man im Kontext des CRISPR/Cas9-vermittelten Genome-Editings unter Indels ?
-> Deletionen und Insertionen
-> Indels führen zum Funktionsverlust des Genproduktes
-> Indels sind das Ergebnis des Genome-Editings
Wie viele Endonukleasen-Domänen enthält Cas9 ?
-> 2
-> Eine pro Einzelstrang der dsDNA
Beim Genome-Editing entstehen Doppelstrangbrüche. Wie werden diese repariert ?
-> Durch Nicht-homologe Endverknüpfung
-> Durch homologe Reparatur
