Isolation des protéines Flashcards
Nommer quelques techniques pour briser la cellule et relâcher le lysat
Lyse osmotique (Solutions hypotonique, fonctionne moins bien avec les cellules possédant des parois)
Mécaniques :
Broyage avec du sable, billes de verre
Déchiquetage mécanique (type Waring)
Homogénéisateur(Potter en téflon)
Rupture à haute pression (French press)
Sonication par vibration ultrasonique)
Qu’est-ce qu’on peut faire avec le lysat pour mieux récolter nos protéines d’intérêt ?
Le filtrer, les prots se retrouvent dans le surnageant
Comment peut-on séparer les différentes parties des cell. une fois le lysat obtenu ?
Centrifugation différentielle, chromatographie
3 paramètres à contrôler pour maintenir l’intégrité structurel de la protéine + comment ?
Le pH, la température et les protéases
pH : Tampon de zone physiologique (6.5-8)
Température : Mettre sur glace
Protéases : Ajouter des inhibiteurs
Quelles sont les 4 propriétés physico-chimique et quelles sont leurs techniques de séparation ?
Solubilité ; Précipitation
Charge ionique ; Chromatographie par échange d’ions, électrophorèse, focalisatoin isoélectrique
Taille moléculaire ; Ultracentrifugation, chromatographie par gel-filtration, électrophorèse
Spécificité ; Chromatographie d’affinité
De quoi dépend la solubilité des protéines ? et donc qu’est qu’on peut changer ?
Interactions polaires avec le solvant aqueux
Interactions ioniques avec les sels en solution
Forces électrostatiques répulsives entre les mol. de charge similaire
-La force ionique (concentration saline)
-ajout de solvants organiques
-pH
-ajout de polymères inertes
Expliquer le principe de salting in et salting out
Salting in ; on augmente graduellement la concentration de sel, ces sels lient directement les protéines et augmentent la charge nette => Augmente l’attraction avec l’eau + Augmente la répulsion entre les protéines
Salting out ; on augmente beaucoup la concentration de sel, ces liens avec l’eau entre en compétition avec les protéines pour le contact avec le solvant et on diminue leur solubilité
Salting in, on augmente la solubilité, salting out, on diminue la solubilité
À quel moment peut-on utiliser le principe de dessalage par dialyse ?
Lorsque nous utilisons un tampon de faible force ionique
Pour quel type de protéine peut-on utiliser le principe de salting out ?
Pour des protéines hydrophobes
Comment se nomment les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéines ?
Les sels chaotropiques, ils peuvent dénaturer la protéine
Que sont les sels optimaux ?
Favorisent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes. Ils n’ont aucune interactions avec la protéine
Nommer un sel utilisé pour la précipitation
sulfate d’ammonium (NH4)2SO4
Comment fait-on pour faire précipiter une protéine avec un point isoélectrique de 3 ? et comment appelle-t-on ce phénomène ?
On l’amène à pH 3 parce que la protéine devient moins soluble à ce pH et permet aux forces locales de prédominer, permettant l’agrégations de cette protéine
Précipitation isoélectrique
Que se passe-t-il si on ajoute des solvants miscibles dans l’eau comme l’éthanol ou l’acétone; à des grosses protéines ; à des petites protéines
Plus grande est la protéine, plus basse est la concentration en solvant organique nécessaire pour la précipiter (Prot. plus large, meilleure chance d’avoir une surface chargée complémentaire avec une autre protéine)
