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module 1 MMD1045 > intro diagnostic moléculaire > Flashcards

intro diagnostic moléculaire Flashcards

1
Q

nb de variations moyenne

A

5-6 M dont 70 de novo

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2
Q

variations non-patho ont tendance à arriver où

A

introns/UTR/régions intergénique: non-codantes

*peuvent être polyphormisme fréquent ou s’exprimer récessivement donc pas de phénotype à moins d,ëtre homozygote pour la mutation

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3
Q

causes externes variations

A

radiation
uv
chimiques =>agent alkylants

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4
Q

cause internes variations

A 
erreur polymérase 
erreur réplication / recombinaison
déamination 
dépurination 
méthylation 
radicaux libres
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5
Q

mutation la plus fréquente

A

CG => TG (20x + fréquent au’autres)
C méthylé = U
U transformé en T

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6
Q

variations grandes tailles

A

variation nb de copies CNV

LINE

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7
Q

variations moyennes tailles

A

microsatellites: répétitions

* utilisées pour marquage

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8
Q

variations petites tailles

A

SNP (un nucléotide / 100 est changé)

indels

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9
Q

mutations patho les plus fréquentes

A

substitution ( un nucléotide pour un autre)

=> donc soit transition ou transversions

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10
Q

variation homologue

A

codon remplacé par un autre, code pour le mm aa (pas d’effet) => patient sain ou condition bénigne

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11
Q

variation faux-sens (missense)

A

condon remplacé pour un qui code pour un autre aa

=> effet varié patho ou pas

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12
Q

variation non-sens (nonsense)

A

codon remplacé par codon stop

=> patho

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13
Q

variation de frameshift (alteration du cadre de lecture)

A

insertion/délétion pas multiple de 3: entraîne codon stop précoce
patho

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14
Q

éléments à considérer dans l’analyse de variation pour voir si corrélée aux sx du patients

A
  • fréquence de la variation dans la pop
  • conservation (gène pas conservé d’hab= pas patho)
  • impact ARNm
  • impact protéine
  • fonction gène en jeu
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15
Q

perte/gain de fonction comprennent quoi

A

quantité protéine traduite & son activité

=> tous 2 entraîne phénotype

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16
Q

mécanismes gain de fonction

A
    • dosage génique
    • activité protéine
  • alteration expression ARNm (ds promoteur ex)
  • nouvelle fct protéine
  • altérations toxiques prot (devenue résistante ex)
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17
Q

les maladies qui nécessitent de grandes expansions (mutations dynamiques) touchent quelle partie du gène muté

A

intron/UTR; les régions non-codantes

les maladies avec petites expansions qui causent le phénotype se font dans l’exon

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18
Q

je veux isoler de l’ADN mais j’ai seulement accès au sang de mon patient, quelle cellule sera précisément utile

A

leucocyte: noyau

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19
Q

2 méthodes d’isolation ADN

A
  1. phénol-chlorophorme
    => extraction liq-liq: solubilité protéine différente de l’ADN: les protéines sont en phase organique: ADN précipité après centrifugation
  2. sels chaotropiques
    => ADN colle à une membrane ou sur du verre, le reste est en solution
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20
Q

comment on évalue l’efficacité de notre isolation ADN

A
  1. densité optique
    absorbance max ADN = 260 nm tandis que prot = 280
  2. teintures intercalantes fixées à ADN double brins pour estimer taille/qté
    (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
21
Q

technique par hybridation

A

sonde complémentaire soit à la séq sauvage (saine) ou mutée et couleur différente pour chaque option

22
Q

électrophorèse capillaire

A

gros fragment migre moins que petit: on peut spot des délétions fréquentes, utilisé avec d’autres techniques pour des expansions, insertions/délétions (PCR)

23
Q

Buvardage Southern

A

PAS DE PCR
électrophorèse et hybridation POUR GRANDES EXPANSIONS (x fragile)

digère ADN 
électrophorèse 
transfert sur membrane 
hybride 
détecte par autoradiographie

si un point semble (grâce à hybridation complémentaire) moins migrer, c’est qu’il est plus gros et donc cette partie du gène a subit une expansion.

24
Q

PCR

A

duplique x bcp les séquences qu’on veut grâce à une polymérase (taq bcp utilisée)

dénature (chauffe)
lie polymérase pour copié l’ADN simple brin
renature (refroidit)

++ cycles : la séquence double à chaque cycle donc 2 exposant n où n est le nb de cycles

25
Q

v ou f

les polymérase dans PCR sont infaillible, ne sont jamais responsable de mutations

A

f

taux d’erreur pour chaque

26
Q

que détecte PCR-migration

A

délétions / insertions
qu’on spot par électrophorèse
ou puits où signal selon son changement de taille

27
Q

Champs d’application PCR-migration

A

insertions/délétions récurrentes
ou
analyses d’identité génétique (contamination foeto-maternelle ou judiciaire ou insatbilité microsatellites)

28
Q

PCR-digestion

A

enzyme de restriction coupe le produit de PCR à un site spécifique.
si séquence mutée: enzyme ne coupe pas: séquence plus longue qu’à la normale pcq site de restriction abolit, spot par électrophorèse

la mutation abolit ou crée un site de restriction

29
Q

applications pcr-digestion

A

mutations ponctuelles récurrentes

30
Q

Allele Specific Primer Extension

A

amplifie par PCR
amorces fluo: si ça match 3’ => extension, sinon, si ça mismatch 3’ on bloque l’extension là

DÉTECTE LES SNP (++)

31
Q

Séquençage Sanger

A

électrophorèse sur gel + précis (détecte avec fluorescence, mesure différence de 1 nucléotide)

  1. PCR amplifie
  2. Dénaturation
  3. Réamplifie un mix de nucléotides normaux et modifiés (marqués par fluo)

les nucléotides modifiés = ddNTP = pas de OH au ribose donc empêche la poursuite de l’élongation.

On bloque l’élongation de la séquence à plusieurs endroits différents (pour ça qu’on amplifie la même séquence) par exemple, à tous les G. On peut donc voir par électrophorèse tous les endroits où il y a des G dans la séquence et détecter un SNP. (mais aléatoire, pas précis à un nucléotide) on essaie de faire un stop à toutes les pb pour dresser un portrait général de la séquence

32
Q

ddNTP dans sanger

A

didésoxyribonucléotide est un nucléotide dont les groupements 2’OH et 3’OH du ribose sont absents:

inhibe l’élongation de la séquence par polymérase (3’) parce que sans OH au C3 du ribose, le prochain dNTP ne peut pas se lier: CHAIN TERMINATION.

33
Q

avantage du séquençage sanger

A

pas besoin de savoir exactement la mutation qu’on cherche

34
Q

pour faire le séquençage d’une gènome au complet, on privilégie

a) sanger
b) séquençage nouvelle génération

A

b) séquençage nouvelle génération

35
Q

application sanger

A
  • quand ++ mutations dispersées aléatoirement dans le gène
  • cas de SUBSTITUTION
  • petites insertions/ délétions
  • PAS grandes anomalies de dosage
36
Q

Techniques pour insertions/ délétions

A

pcr-migration (électrophorèse)
petites: Sanger (mais pas grandes)
TaqMan; PCR en temps réel (??)
MLPA (dél & dup)

37
Q

Techniques pour subsitution (inclue SNP)

A

Sanger

Allele Specific Primer Extension

38
Q

Technique pour mutations ponctuelles récurrentes

A

pcr-digestion

39
Q

Technique analyse identité génétique (judiciaire, contamination FM, microsatellites)

A

pcr-migration

40
Q

Technique pour expansions

A

électrophorèse capillaire

Buvardage Southern

41
Q

PCR temps-réel

A

détection simultanée des produits (on peut voir en temps réel si la polymérase fait une erreur de copie/recombi)

permet la discrimination allélique (amorce et sonde marquées)
& quantification relative/absolue (seuil quantitatif de fluorescence commun pour tous les patients testés)

comme PCR mais moins de manipulation

42
Q

TaqMan

A

PCR temps-réel

reporteur fluo à l’extrémité 5’ de la sonde est inhibé par quencher à l’extrémité 3’ : sondes libres en solutions ne sont pas fluo

Taq polymérase libère le reporteur à chaque hybridation sonde+ADN complémentaire du patient.

Reporteur libre = fluo visible

Réduit l’émission de fluo non-spécifique par mauvais appariement

Niveau de fluo proportionnel aux bonnes hybridation.
Si le seuil attendu est atteint plus lentement que la normale, ça veut dire qu’il y avait moins d’ADN initialement aka délétion.

43
Q

interprétation PCR temps-réel quantitative

A

si patient A reach le seuil de fluorescence établit préalablement après 24 cycles et patient B le reach après 25 cycles, on peut penser que patient B avait 2x moins d’ADN au départ (pcq ADN double à chaque cycle et lui il a n+1 p/r a patient A). on suppose donc une délétion

44
Q

MLPA: Mulplex Ligation Probe Amplification

A

dél/dup dans plusieurs régions d’un gène: spot les copies d’une même séquence dans un gène

  1. 2 sonde en ss-unités qui s’assemblent sur ADN patient et liées par ligase
  2. amplification PCR sonde+ADN
  3. électrophorèse

sur le diagramme de résultat, on voit la quantité de chaque exon comparé à un contrôle

45
Q

séquençage de nouvelle génération

A

COMPARTIMENTS
=> multiplie l’info obtenue en analyse
=> analyse ++ gènes de ++ patients en mm temps

analyse bioinformatique:
1. ++ séquences de 100-150 pb attitré à chaque patient avec code-barre moléculaire

  1. alignement séquences dans le génome (cette séq appartient à quel gène)
  2. identifier si variations de ces séquences ont déjà été discutées
  3. variations patho? est-ce qu’il sont dans des gènes qui pourrait expliquer le phénotype du patient?
46
Q

dans le séquençage de nouvelle génération, comment on détermine quelle partie appartient à quel patient

A

grâce aux code-barre unique à la séquence de chaque patient

47
Q

pcr-émulsion

A

pcr se fait dans des micelles d’huile
1 bulle = 1 rxn d’un gène pour 1 patient
on brise l’émulsion aka les bulles pour mettre le produit dans des plaques à puits pour séquencer

48
Q

pcr-cluster

A

comme pcr-émulsion, c’est une amplification en parallèle mais ici les séquences ADN sont fixées sur une plaque “flow cell”

49
Q

amplification parallèle

A

pcr-émulsion & pcr-cluster : ++ gènes de ++ patients amplifiés en même temps

module 1 MMD1045 (4 decks)

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