intro diagnostic moléculaire Flashcards
nb de variations moyenne
5-6 M dont 70 de novo
variations non-patho ont tendance à arriver où
introns/UTR/régions intergénique: non-codantes
*peuvent être polyphormisme fréquent ou s’exprimer récessivement donc pas de phénotype à moins d,ëtre homozygote pour la mutation
causes externes variations
radiation
uv
chimiques =>agent alkylants
cause internes variations
erreur polymérase erreur réplication / recombinaison déamination dépurination méthylation radicaux libres
mutation la plus fréquente
CG => TG (20x + fréquent au’autres)
C méthylé = U
U transformé en T
variations grandes tailles
variation nb de copies CNV
LINE
variations moyennes tailles
microsatellites: répétitions
* utilisées pour marquage
variations petites tailles
SNP (un nucléotide / 100 est changé)
indels
mutations patho les plus fréquentes
substitution ( un nucléotide pour un autre)
=> donc soit transition ou transversions
variation homologue
codon remplacé par un autre, code pour le mm aa (pas d’effet) => patient sain ou condition bénigne
variation faux-sens (missense)
condon remplacé pour un qui code pour un autre aa
=> effet varié patho ou pas
variation non-sens (nonsense)
codon remplacé par codon stop
=> patho
variation de frameshift (alteration du cadre de lecture)
insertion/délétion pas multiple de 3: entraîne codon stop précoce
patho
éléments à considérer dans l’analyse de variation pour voir si corrélée aux sx du patients
- fréquence de la variation dans la pop
- conservation (gène pas conservé d’hab= pas patho)
- impact ARNm
- impact protéine
- fonction gène en jeu
perte/gain de fonction comprennent quoi
quantité protéine traduite & son activité
=> tous 2 entraîne phénotype
mécanismes gain de fonction
- dosage génique
- activité protéine
- alteration expression ARNm (ds promoteur ex)
- nouvelle fct protéine
- altérations toxiques prot (devenue résistante ex)
les maladies qui nécessitent de grandes expansions (mutations dynamiques) touchent quelle partie du gène muté
intron/UTR; les régions non-codantes
les maladies avec petites expansions qui causent le phénotype se font dans l’exon
je veux isoler de l’ADN mais j’ai seulement accès au sang de mon patient, quelle cellule sera précisément utile
leucocyte: noyau
2 méthodes d’isolation ADN
- phénol-chlorophorme
=> extraction liq-liq: solubilité protéine différente de l’ADN: les protéines sont en phase organique: ADN précipité après centrifugation - sels chaotropiques
=> ADN colle à une membrane ou sur du verre, le reste est en solution
comment on évalue l’efficacité de notre isolation ADN
- densité optique
absorbance max ADN = 260 nm tandis que prot = 280 - teintures intercalantes fixées à ADN double brins pour estimer taille/qté
(SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
technique par hybridation
sonde complémentaire soit à la séq sauvage (saine) ou mutée et couleur différente pour chaque option
électrophorèse capillaire
gros fragment migre moins que petit: on peut spot des délétions fréquentes, utilisé avec d’autres techniques pour des expansions, insertions/délétions (PCR)
Buvardage Southern
PAS DE PCR
électrophorèse et hybridation POUR GRANDES EXPANSIONS (x fragile)
digère ADN électrophorèse transfert sur membrane hybride détecte par autoradiographie
si un point semble (grâce à hybridation complémentaire) moins migrer, c’est qu’il est plus gros et donc cette partie du gène a subit une expansion.
PCR
duplique x bcp les séquences qu’on veut grâce à une polymérase (taq bcp utilisée)
dénature (chauffe)
lie polymérase pour copié l’ADN simple brin
renature (refroidit)
++ cycles : la séquence double à chaque cycle donc 2 exposant n où n est le nb de cycles
v ou f
les polymérase dans PCR sont infaillible, ne sont jamais responsable de mutations
f
taux d’erreur pour chaque
que détecte PCR-migration
délétions / insertions
qu’on spot par électrophorèse
ou puits où signal selon son changement de taille
Champs d’application PCR-migration
insertions/délétions récurrentes
ou
analyses d’identité génétique (contamination foeto-maternelle ou judiciaire ou insatbilité microsatellites)
PCR-digestion
enzyme de restriction coupe le produit de PCR à un site spécifique.
si séquence mutée: enzyme ne coupe pas: séquence plus longue qu’à la normale pcq site de restriction abolit, spot par électrophorèse
la mutation abolit ou crée un site de restriction
applications pcr-digestion
mutations ponctuelles récurrentes
Allele Specific Primer Extension
amplifie par PCR
amorces fluo: si ça match 3’ => extension, sinon, si ça mismatch 3’ on bloque l’extension là
DÉTECTE LES SNP (++)
Séquençage Sanger
électrophorèse sur gel + précis (détecte avec fluorescence, mesure différence de 1 nucléotide)
- PCR amplifie
- Dénaturation
- Réamplifie un mix de nucléotides normaux et modifiés (marqués par fluo)
les nucléotides modifiés = ddNTP = pas de OH au ribose donc empêche la poursuite de l’élongation.
On bloque l’élongation de la séquence à plusieurs endroits différents (pour ça qu’on amplifie la même séquence) par exemple, à tous les G. On peut donc voir par électrophorèse tous les endroits où il y a des G dans la séquence et détecter un SNP. (mais aléatoire, pas précis à un nucléotide) on essaie de faire un stop à toutes les pb pour dresser un portrait général de la séquence
ddNTP dans sanger
didésoxyribonucléotide est un nucléotide dont les groupements 2’OH et 3’OH du ribose sont absents:
inhibe l’élongation de la séquence par polymérase (3’) parce que sans OH au C3 du ribose, le prochain dNTP ne peut pas se lier: CHAIN TERMINATION.
avantage du séquençage sanger
pas besoin de savoir exactement la mutation qu’on cherche
pour faire le séquençage d’une gènome au complet, on privilégie
a) sanger
b) séquençage nouvelle génération
b) séquençage nouvelle génération
application sanger
- quand ++ mutations dispersées aléatoirement dans le gène
- cas de SUBSTITUTION
- petites insertions/ délétions
- PAS grandes anomalies de dosage
Techniques pour insertions/ délétions
pcr-migration (électrophorèse)
petites: Sanger (mais pas grandes)
TaqMan; PCR en temps réel (??)
MLPA (dél & dup)
Techniques pour subsitution (inclue SNP)
Sanger
Allele Specific Primer Extension
Technique pour mutations ponctuelles récurrentes
pcr-digestion
Technique analyse identité génétique (judiciaire, contamination FM, microsatellites)
pcr-migration
Technique pour expansions
électrophorèse capillaire
Buvardage Southern
PCR temps-réel
détection simultanée des produits (on peut voir en temps réel si la polymérase fait une erreur de copie/recombi)
permet la discrimination allélique (amorce et sonde marquées)
& quantification relative/absolue (seuil quantitatif de fluorescence commun pour tous les patients testés)
comme PCR mais moins de manipulation
TaqMan
PCR temps-réel
reporteur fluo à l’extrémité 5’ de la sonde est inhibé par quencher à l’extrémité 3’ : sondes libres en solutions ne sont pas fluo
Taq polymérase libère le reporteur à chaque hybridation sonde+ADN complémentaire du patient.
Reporteur libre = fluo visible
Réduit l’émission de fluo non-spécifique par mauvais appariement
Niveau de fluo proportionnel aux bonnes hybridation.
Si le seuil attendu est atteint plus lentement que la normale, ça veut dire qu’il y avait moins d’ADN initialement aka délétion.
interprétation PCR temps-réel quantitative
si patient A reach le seuil de fluorescence établit préalablement après 24 cycles et patient B le reach après 25 cycles, on peut penser que patient B avait 2x moins d’ADN au départ (pcq ADN double à chaque cycle et lui il a n+1 p/r a patient A). on suppose donc une délétion
MLPA: Mulplex Ligation Probe Amplification
dél/dup dans plusieurs régions d’un gène: spot les copies d’une même séquence dans un gène
- 2 sonde en ss-unités qui s’assemblent sur ADN patient et liées par ligase
- amplification PCR sonde+ADN
- électrophorèse
sur le diagramme de résultat, on voit la quantité de chaque exon comparé à un contrôle
séquençage de nouvelle génération
COMPARTIMENTS
=> multiplie l’info obtenue en analyse
=> analyse ++ gènes de ++ patients en mm temps
analyse bioinformatique:
1. ++ séquences de 100-150 pb attitré à chaque patient avec code-barre moléculaire
- alignement séquences dans le génome (cette séq appartient à quel gène)
- identifier si variations de ces séquences ont déjà été discutées
- variations patho? est-ce qu’il sont dans des gènes qui pourrait expliquer le phénotype du patient?
dans le séquençage de nouvelle génération, comment on détermine quelle partie appartient à quel patient
grâce aux code-barre unique à la séquence de chaque patient
pcr-émulsion
pcr se fait dans des micelles d’huile
1 bulle = 1 rxn d’un gène pour 1 patient
on brise l’émulsion aka les bulles pour mettre le produit dans des plaques à puits pour séquencer
pcr-cluster
comme pcr-émulsion, c’est une amplification en parallèle mais ici les séquences ADN sont fixées sur une plaque “flow cell”
amplification parallèle
pcr-émulsion & pcr-cluster : ++ gènes de ++ patients amplifiés en même temps
