Intra - A Flashcards

1
Q

Quel est le dogme central de la biologie moléculaire et que représente-t-il?

A

C’est le flux d’information génétique. Il montre que l’information passe de l’ADN à l’ARN, puis à la protéine. Les transferts peuvent être généraux, spéciaux ou inconnus, selon la nature des molécules impliquées.

Cela signifie que l’ADN est transcrit en ARN (transcription), et l’ARN est traduit en protéines (traduction). L’ADN et l’ARN peuvent s’auto-répliquer et l’ARN peut être rétrotranscrit en ADN. Les protéines ne peuvent ni s’autorépliquer, ni produire de l’ADN ou de l’ARN.

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2
Q

Décrivez le concept du “monde ancestral des ARN”.

A

Le concept du monde ancestral des ARN propose qu’avant l’existence de l’ADN et des protéines, l’ARN était la molécule centrale de la vie primitive. Selon cette théorie, l’ARN jouait à la fois le rôle de stockage de l’information génétique (comme l’ADN) et de catalyseur (comme les protéines (ribozymes)). Cela implique que l’ARN pourrait avoir été la première molécule à initier les réactions biochimiques nécessaires à la vie.

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3
Q

Quelles sont les étapes de l’évolution moléculaire selon le concept du monde de l’ARN?

A

Selon le concept du monde de l’ARN, les étapes de l’évolution moléculaire sont les suivantes :
1. Formation de nucléotides à partir de réactions chimiques aléatoires.
2. Formation de l’ARN capable d’auto-réplication (ribozymes).
3. L’ARN catalyse la synthèse des protéines.
4. L’ARN encode les informations nécessaires pour produire des protéines et de l’ADN.
5. Transition vers un système ADN-ARN-protéine où l’ADN devient le support principal de l’information génétique, l’ARN servant de messager, et les protéines remplissant la plupart des fonctions catalytiques.

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4
Q

Pourquoi le concept du monde de l’ARN est-il crucial pour comprendre les origines de la vie?

A

Le concept du monde de l’ARN est crucial car il fournit une explication plausible sur la façon dont la vie a pu évoluer à partir de molécules simples. L’ARN, capable à la fois de stocker de l’information génétique et de catalyser des réactions, pourrait avoir initié les premiers processus biochimiques, menant à l’évolution des systèmes plus complexes que nous connaissons aujourd’hui.

L’ADN est plus stable, donc avec son apparition, les premières formes de vies sont apparues (LUCA).

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5
Q

Quelles sont les principales différences structurelles entre l’ADN et l’ARN?

A

L’ADN (acide désoxyribonucléique) est une double hélice composée de deux brins antiparallèles, alors que l’ARN (acide ribonucléique) est généralement simple brin. Les bases de l’ADN sont l’adénine (A), la thymine (T), la guanine (G), et la cytosine (C), tandis que dans l’ARN, la thymine est remplacée par l’uracile (U). De plus, le sucre dans l’ARN est le ribose, tandis que dans l’ADN, c’est le désoxyribose.

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6
Q

Quel type de structures l’ARN peut-il former en plus de sa forme simple brin?

A

L’ARN peut former des structures double brin hybrides en s’appairant soit avec un autre brin d’ARN, soit avec un brin d’ADN. Ces structures hybrides sont possibles grâce à la complémentarité des bases.

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7
Q

Quels sont les appariements de bases typiques dans l’ADN et l’ARN selon les paires de Watson-Crick?

A

Dans l’ADN :
- A-T (adénine avec thymine)
- G-C (guanine avec cytosine)

Dans l’ARN :
- A-U (adénine avec uracile)
- G-C (guanine avec cytosine)

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8
Q

Quelles sont les paires de bases atypiques ou “wobble” que l’on peut retrouver dans l’ARN?

A

Les paires de bases atypiques dans l’ARN incluent :
- G-U (guanine avec uracile)
- I-U (inosine avec uracile)
- I-A (inosine avec adénine)
- I-C (inosine avec cytosine)

Ces appariements atypiques se retrouvent souvent dans les ARNt (ARN de transfert), où la flexibilité est importante pour reconnaître plusieurs codons.

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9
Q

Pourquoi les paires “wobble” dans l’ARN sont-elles importantes?

A

L’inosine (I) est une base atypique qui joue un rôle clé dans les ARNt, car elle permet des appariements flexibles avec plusieurs bases (U, A, ou C). Cette flexibilité facilite la reconnaissance de plusieurs codons par un même ARNt, contribuant ainsi à la réduction du nombre total d’ARNt nécessaires pour décoder le génome.

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10
Q

Quel est l’impact de la présence de l’uracile (U) dans l’ARN par rapport à la thymine (T) dans l’ADN?

A

L’uracile (U) remplace la thymine (T) dans l’ARN, ce qui modifie légèrement la stabilité de la molécule. L’uracile s’apparie de la même manière que la thymine avec l’adénine, mais il est chimiquement moins stable, rendant l’ARN plus susceptible aux dégradations que l’ADN.

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11
Q

Quelles sont les différentes structures secondaires que l’ARN peut adopter?

A
  • Hélice
  • Tige-boucle
  • Gonflement
  • Boucle interne
  • Boucle à branchements multiples

Ces structures se forment grâce à l’appariement de bases entre des régions complémentaires au sein du même brin d’ARN.

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12
Q

Décrivez ce qu’est une structure tige-boucle dans un ARN.

A

Une structure tige-boucle est formée lorsque deux régions complémentaires d’un brin d’ARN s’apparient pour créer une tige (hélice double brin), suivie d’une région non appariée qui forme la boucle. Ce type de structure est fréquent dans les ARN régulateurs et dans les régions de l’ARN messager influençant la stabilité et la traduction.

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13
Q

Quelle est la forme typique de l’ARN de transfert (ARNt) en 2D et en 3D?

A

2D : trèfle

3D : ‘L’

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14
Q

Quelle est la principale différence dans l’organisation génomique entre les procaryotes et les eucaryotes?

A

Procaryotes : l’ADN est présent sous forme d’une structure circulaire compacte, sans nucléosomes. Il est condensé dans une région appelée nucléoïde.

Eucaryotes : l’ADN est linéaire, enroulé autour des histones pour former la chromatine et stocké dans le noyau, ce qui facilite sa régulation et sa protection.

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15
Q

Quelle est la taille typique du génome chez les procaryotes et les eucaryotes, selon les exemples donnés ?

A

Le génome d’E. coli, un procaryote, est de 4,6 millions de paires de bases (Mbp), tandis que le génome humain, un eucaryote, est de 3200 millions de paires de bases (Mbp).

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16
Q

Quelles sont les étapes de l’expression génique dans une cellule procaryote?

A

Une seule étape :

  • Transcription : L’ADN est transcrit en ARN messager (ARNm).
  • Traduction : L’ARNm est directement traduit en protéine par les ribosomes dans le cytoplasme, sans séparation physique entre les deux processus.
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17
Q

Quelles sont les étapes de l’expression génique dans une cellule eucaryote?

A

Plusieurs étapes :
1. Transcription : L’ADN est transcrit en un ARN primaire (pré-ARNm) dans le noyau.

  1. Maturation de l’ARN : Le pré-ARNm subit une maturation, comprenant l’ajout d’une coiffe en 5’, l’ajout d’une queue poly-A en 3’, et l’épissage pour enlever les introns.
  2. Transport : L’ARNm mature est transporté hors du noyau vers le cytoplasme.
  3. Traduction : L’ARNm est ensuite traduit en protéine par les ribosomes dans le cytoplasme.
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18
Q

Comment les gènes sont-ils organisés chez les procaryotes par rapport aux eucaryotes?

A

Chez les procaryotes, les gènes sont souvent organisés sous forme d’opérons, ce qui signifie que plusieurs gènes codant pour des protéines fonctionnellement liées (par exemple, impliquées dans une même voie métabolique) sont transcrits ensemble sous la forme d’un ARNm polycistronique.

En revanche, chez les eucaryotes, chaque gène est exprimé indépendamment. Les gènes eucaryotes contiennent des régions codantes (exons) et non codantes (introns, 5’UTR, 3’UTR).

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19
Q

Qu’est-ce qu’un ARNm polycistronique et dans quel type de cellule est-il retrouvé?

A

Un ARNm polycistronique est un ARN messager qui code pour plusieurs protéines différentes. Ce type d’ARNm est retrouvé principalement chez les procaryotes, où les gènes sont souvent organisés en opérons, permettant la production simultanée de plusieurs protéines impliquées dans une même voie métabolique.

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20
Q

Quel est l’avantage de l’organisation des gènes en opérons pour les procaryotes?

A

L’organisation en opérons permet aux procaryotes de réguler l’expression de plusieurs gènes en réponse à un seul signal. Cela permet une réponse rapide et coordonnée, particulièrement pour les gènes impliqués dans des voies métaboliques ou des réponses environnementales, ce qui est essentiel pour leur survie dans des environnements changeants.

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21
Q

Pourquoi les gènes eucaryotes sont-ils rarement organisés en opérons?

A

Les gènes eucaryotes sont rarement organisés en opérons car ils sont souvent régulés individuellement pour répondre aux besoins spécifiques de la cellule. Cette régulation individuelle est facilitée par la présence de régions non codantes (introns, promoteurs, enhancers) et la complexité des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle chez les eucaryotes.

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22
Q

Quelles sont les principales différences entre les ARNm procaryotes et eucaryotes?

A

Les ARNm procaryotes sont souvent polycistroniques (un ARNm code pour plusieurs protéines) et ne subissent pas de maturation avant la traduction.

Les ARNm eucaryotes subissent une maturation qui inclut l’ajout d’une coiffe en 5’, l’ajout d’une queue poly-A en 3’, et l’épissage pour enlever les introns. De plus, les ARNm eucaryotes sont généralement monocistroniques (un ARNm code pour une seule protéine).

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23
Q

Que représentent les UTR (régions non traduites) dans les gènes eucaryotes?

A

Les UTR (UnTranslated Regions) sont des régions non codantes situées aux extrémités de l’ARNm, en 5’ et en 3’. La région 5’UTR est située avant le codon de départ et joue un rôle dans la régulation de la traduction, tandis que la région 3’UTR, située après le codon stop, influence la stabilité de l’ARNm et sa localisation dans le cytoplasme.

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24
Q

Comment varie la taille des génomes entre les procaryotes et les eucaryotes?

A

procaryotes < eucaryotes unicellulaires < invertébrés < plantes < vertébrés

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25
Q

Quelle est la taille du génome humain et combien de gènes codant pour des protéines contient-il?

A

Le génome humain a une taille d’environ 3,2 milliards de paires de bases (Gbp) et contient environ 20 000 à 25 000 gènes codant pour des protéines, un nombre similaire à celui de certains organismes plus simples comme Drosophila melanogaster (mouche du vinaigre) ou C. elegans (ver rond).

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26
Q

Quel pourcentage du génome humain code effectivement pour des protéines?

A

Seulement 1,5 % du génome humain code pour des protéines.

Le reste est composé de régions non codantes qui comprennent des séquences régulatrices, des introns et d’autres éléments, dont beaucoup étaient initialement considérés comme de l’ADN non fonctionnel.

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27
Q

Que représentent les transposons dans le génome humain?

A

Les transposons sont des éléments génétiques mobiles qui constituent environ 50 % du génome humain. Ce sont des séquences d’ADN capables de se déplacer d’une position à une autre dans le génome, influençant potentiellement la régulation et la structure génétique.

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28
Q

Quel était l’objectif principal du projet ENCODE?

A

L’objectif principal du projet ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) était de décoder les éléments régulateurs du génome et de comprendre le rôle des séquences non codantes dans la régulation de l’expression génique. Le projet visait à déterminer quelles parties du génome sont fonctionnelles et comment elles contribuent à l’activité cellulaire.

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29
Q

Quel pourcentage du génome humain est exprimé au niveau de l’ARN selon les résultats du projet ENCODE?

A

Environ 75 % du génome humain est exprimé sous forme d’ARN, indiquant que la majorité du génome est transcrit, même si toutes les séquences transcrites ne sont pas traduites en protéines. Ces ARN peuvent avoir des rôles régulateurs ou structurels importants.

30
Q

Quelle était la perception initiale des régions non codantes avant le projet ENCODE et qu’a révélé ce projet?

A

Avant le projet ENCODE, les régions non codantes du génome étaient souvent qualifiées d’« ADN poubelle » (junk DNA), car on pensait qu’elles n’avaient pas de fonction.

Le projet ENCODE a révélé que ces régions non codantes ont en réalité des rôles régulateurs majeurs, influençant l’expression et la régulation des gènes.

Cela a redéfini l’idée d’un génome «actif» et a influencé les recherches sur les maladies génétiques en mettant en évidence des mutations dans des régions non codantes pouvant avoir des effets pathologiques.

31
Q

Quelle est la différence entre un gène codant et un élément régulateur?

A

Un gène codant contient des instructions pour la production d’une protéine spécifique. En revanche, un élément régulateur (comme un promoteur, un enhancer ou un silencer) ne code pas de protéines mais contrôle l’activité des gènes codants en modulant leur transcription.

32
Q

Comment le coût du séquençage d’un génome humain a-t-il évolué depuis les années 2000?

A

Le coût du séquençage d’un génome humain a drastiquement diminué depuis les années 2000.

En 2001, il coûtait environ 100 millions de dollars, mais à partir de 2007, le coût a commencé à baisser rapidement, atteignant environ 1 000 dollars en 2015, grâce aux avancées technologiques dans le domaine du séquençage.

33
Q

Quelles sont les principales technologies de séquençage utilisées de 1980 à nos jours? (pas à connaître en détails)

A
  • Systèmes basés sur gel : méthodes manuelles ou semi-automatisées des années 1980.
  • Séquençage capillaire : technologie de première génération avec automatisation.
  • Pyroséquençage et séquençage de deuxième génération : permettant un séquençage plus rapide à partir des années 2000.
  • Séquençage massif parallèle : avec des lectures courtes (short-read sequencers) et longues (long-read sequencers), ce qui a accéléré la réduction des coûts.
  • Séquençage de troisième génération (séquençage à molécule unique) : une technologie plus récente offrant une grande précision pour les longues séquences.
34
Q

Quelles sont les différences entre le séquençage capillaire et le séquençage de troisième génération?

A

Le séquençage capillaire (première génération) repose sur la séparation des fragments d’ADN par électrophorèse, limitant la taille des séquences à analyser et nécessitant un temps relativement long pour le séquençage.

Le séquençage de troisième génération (séquençage à molécule unique) permet de lire de très longues séquences en temps réel, avec une précision accrue et une réduction significative des coûts et du temps requis.

35
Q

Qu’est-ce que la technique de séquençage Maxam-Gilbert et sur quoi repose-t-elle?

A

La technique de séquençage Maxam-Gilbert est une méthode chimique développée dans les années 1970 qui repose sur la fragmentation de l’ADN.

Elle utilise des produits chimiques spécifiques pour cliver l’ADN à des bases spécifiques (A, G, C, ou T), générant ainsi une série de fragments de différentes longueurs. Chaque fragment est marqué radioactivement (32P), et les produits de clivage sont ensuite séparés par électrophorèse pour déterminer la séquence.

36
Q

Quelles sont les étapes principales de la méthode de séquençage Maxam-Gilbert?

A
  1. Marquage de l’ADN avec un isotope radioactif à une extrémité.
  2. Clivage chimique spécifique (G, A+G, T+C, C) en utilisant des réactifs chimiques.
  3. Fragmentation de l’ADN en plusieurs morceaux de différentes longueurs.
  4. Séparation des fragments par électrophorèse sur gel.
  5. Autoradiographie pour détecter les fragments radioactifs et déduire la séquence d’ADN en lisant les bandes sur le gel.
37
Q

Quels sont les récatifs chimiques utilisés pour le clivage des bases ?

A
  • G : Diméthylsulfate (DMS)
  • A+G : Acide formique
  • T+C : Hydrazine
  • C : Hydrazine + NaCl
38
Q

Quels sont les avantages et inconvénients de la méthode Maxam-Gilbert?

A

Avantages :
- Permet de séquencer l’ADN double brin.
- Peut être utilisé pour les séquences riches en GC, difficiles à séquencer avec d’autres méthodes.

Inconvénients :
- Méthode complexe et dangereuse en raison des produits chimiques utilisés (réactifs toxiques).
- Longue et laborieuse, nécessitant une manipulation précise.

39
Q

Pourquoi la technique de Maxam-Gilbert a-t-elle été remplacée par d’autres méthodes de séquençage?

A

La technique de Maxam-Gilbert a été remplacée par des méthodes comme le séquençage de Sanger et les technologies de nouvelle génération car ces dernières sont plus sûres, plus rapides, et plus faciles à automatiser. Le séquençage de Sanger utilise moins de réactifs toxiques et est plus adapté à l’analyse de séquences longues et complexes.

40
Q

Comment l’électrophorèse sur gel aide-t-elle à déterminer la séquence d’ADN dans la méthode Maxam-Gilbert?

A

L’électrophorèse sur gel sépare les fragments d’ADN en fonction de leur taille. Les fragments plus petits migrent plus loin dans le gel que les fragments plus longs. En comparant les bandes produites par chaque réaction chimique spécifique (clivage à A, G, C, ou T), on peut reconstituer la séquence de bases de l’ADN en lisant les bandes du gel.

41
Q

Qu’est-ce que la méthode de séquençage Sanger et comment fonctionne-t-elle?

A

La méthode de séquençage Sanger est une technique de séquençage d’ADN basée sur l’incorporation de nucléotides modifiés, appelés didésoxyribonucléotides (ddNTP).

Ces ddNTP sont incorporés de façon aléatoire lors de la synthèse de l’ADN, provoquant l’arrêt de la polymérisation.

Cela génère des fragments d’ADN de différentes longueurs, qui sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel pour déterminer la séquence.

42
Q

Quels sont les composants principaux utilisés dans la réaction de séquençage Sanger?

A
  • Un brin matrice d’ADN à séquencer.
  • Un amorce spécifique (oligonucléotide) marquée par un isotope radioactif pour initier la synthèse.
  • Les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP : dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
  • Les quatre didésoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP).
  • Une ADN polymérase pour catalyser la synthèse.
43
Q

Comment la méthode Sanger permet-elle de déterminer la séquence d’ADN?

A

Lors de la synthèse d’ADN, les ddNTP sont incorporés aléatoirement à la place des dNTP, ce qui provoque l’arrêt de l’élongation du brin. Chaque tube de réaction contient un type de ddNTP (ddA, ddT, ddC, ou ddG), générant ainsi des fragments de différentes tailles. Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse, et la position de chaque ddNTP est identifiée, permettant de reconstituer la séquence du brin matrice.

44
Q

Quelle est la différence entre un ribonucléotide, un désoxyribonucléotide, et un didésoxyribonucléotide?

A

Un ribonucléotide (NTP) a un groupe hydroxyle (–OH) sur le carbone 2’ et 3’ du sucre ribose.

Un désoxyribonucléotide (dNTP) a seulement un groupe hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre désoxyribose.

Un didésoxyribonucléotide (ddNTP) n’a pas de groupe hydroxyle ni en 2’ ni en 3’, ce qui empêche l’ajout de nouveaux nucléotides et bloque l’élongation de la chaîne d’ADN.

45
Q

Pourquoi l’ajout d’un didésoxyribonucléotide (ddNTP) arrête-t-il la synthèse de l’ADN dans la méthode Sanger?

A

L’ajout d’un ddNTP arrête la synthèse de l’ADN car le ddNTP manque de groupe hydroxyle (–OH) en position 3’. Ce groupe est nécessaire pour la formation de la liaison phosphodiester avec le nucléotide suivant. Sans ce groupe, l’élongation du brin est bloquée, générant ainsi un fragment d’ADN de longueur définie.

46
Q

Quelles sont les étapes principales de la méthode de séquençage Sanger?

A
  1. Préparation de quatre réactions de synthèse séparées, chacune contenant un ddNTP différent (ddA, ddT, ddC, ou ddG).
  2. Incorporation aléatoire des ddNTP à des ratios différents pendant la synthèse de l’ADN, générant des fragments de différentes longueurs.
  3. Séparation des fragments par électrophorèse sur gel d’acrylamide.
  4. Lecture de la séquence d’ADN en analysant la position des bandes pour chaque ddNTP.
47
Q

Quels sont les avantages et inconvénients de la méthode Sanger par rapport aux autres méthodes de séquençage?

A

Avantages :
- Haute précision et faible taux d’erreur.
- Adaptée pour séquencer des fragments d’ADN de petite à moyenne taille.

Inconvénients :
- Longue et coûteuse pour de grands génomes.
- Difficile à automatiser à grande échelle.

48
Q

Comment la méthode Sanger a-t-elle été automatisée et quel est le rôle de l’électrophorèse capillaire?

A

La méthode Sanger a été automatisée grâce à l’utilisation de l’électrophorèse capillaire. Dans cette version automatisée, les quatre réactions de séquençage (avec ddA, ddT, ddC, ddG) sont marquées avec des fluorochromes distincts, permettant de détecter chaque nucléotide par son signal fluorescent unique. Les fragments sont séparés par électrophorèse capillaire, puis détectés par un laser, ce qui génère un chromatogramme montrant la séquence d’ADN.

49
Q

Quelle est la différence principale entre l’électrophorèse capillaire et l’électrophorèse sur gel traditionnelle?

A

L’électrophorèse capillaire utilise des capillaires fins pour séparer les fragments d’ADN, au lieu d’un gel plat.

Comparée à l’électrophorèse sur gel traditionnelle, cette méthode est :
- Plus rapide : détection automatisée des signaux fluorescents en temps réel.
- Plus sensible : séparation plus fine des fragments d’ADN.

50
Q

Comment la fluorescence est-elle utilisée dans la méthode Sanger automatisée?

A

Chaque didésoxyribonucléotide (ddNTP) est marqué par un fluorochrome spécifique (par exemple, le ddATP avec un fluorochrome vert, le ddCTP avec un bleu, etc.). Lorsque ces ddNTP sont incorporés dans le brin d’ADN, ils émettent un signal fluorescent détecté par un laser à la fin de la séparation capillaire. La couleur du signal permet de déterminer quel ddNTP a été incorporé, et donc d’identifier la base correspondante.

51
Q

Qu’est-ce que le pyro-séquençage et comment fonctionne-t-il?

A

Le pyro-séquençage est une méthode de séquençage de nouvelle génération qui repose sur la détection de la libération de pyrophosphate (PPi) lors de l’incorporation d’un nucléotide. Chaque nucléotide (A, T, C, ou G) est ajouté un par un dans une chambre de réaction. Si le nucléotide est complémentaire à la matrice, il est incorporé, et l’enzyme luciférase convertit le pyrophosphate libéré en un signal lumineux proportionnel à la quantité de nucléotides ajoutés.

52
Q

Quels sont les enzymes clés impliqués dans le processus de pyro-séquençage et quel est leur rôle?

A
  • Sulfurylase : Convertit le pyrophosphate (PPi) et l’adénosine phosphosulfate (APS) en ATP.
  • Luciférase : Utilise l’ATP pour convertir la luciférine en oxyluciférine, générant un signal lumineux détectable.

Ces réactions enzymatiques permettent de détecter l’incorporation d’un nucléotide par la production d’un flash lumineux.

53
Q

Comment le signal lumineux est-il généré dans le pyro-séquençage?

A

Le signal lumineux est généré lorsque le pyrophosphate (PPi), libéré lors de l’incorporation d’un nucléotide, est converti en ATP par la sulfurylase. L’ATP produit est ensuite utilisé par la luciférase pour convertir la luciférine en oxyluciférine, émettant ainsi de la lumière. L’intensité du signal lumineux est proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés, permettant de déterminer la séquence.

54
Q

Quelles sont les étapes principales du pyro-séquençage?

A
  • Fragmentation de l’ADN matrice et immobilisation sur des billes.
  • Amplification clonale de chaque fragment par PCR en émulsion.
  • Séquençage dans une chambre de réaction où les nucléotides sont ajoutés un par un.
  • Détection de la lumière générée par l’incorporation de chaque nucléotide.
  • Analyse des signaux lumineux pour déterminer la séquence.
55
Q

Quels sont les avantages et les inconvénients du pyro-séquençage par rapport à la méthode Sanger?

A

Avantages :
- Séquençage de grandes quantités de fragments en parallèle, ce qui permet un séquençage à haut débit et réduit le coût par base séquencée.
- Rapide et permet une détection en temps réel sans besoin d’électrophorèse capillaire.

Inconvénients :
- Difficulté à séquencer des régions riches en homopolymères (séquences répétées d’un même nucléotide), car le signal lumineux peut être difficile à quantifier précisément.
- Cette méthode peut générer des erreurs dans l’estimation du nombre exact de bases consécutives.

56
Q

Quelles sont les différences entre le séquençage Sanger automatisé et le pyro-séquençage en termes de détection?

A

Dans le séquençage Sanger automatisé, la détection repose sur l’analyse de signaux fluorescents provenant de ddNTP marqués.

Le pyro-séquençage détecte la libération de pyrophosphate sous forme de signal lumineux à chaque incorporation de nucléotide.

Le Sanger est idéal pour les séquences courtes et précises, tandis que le pyro-séquençage est plus adapté pour des lectures de haut débit de multiples fragments.

57
Q

Qu’est-ce que le séquençage Illumina et en quoi consiste-t-il?

A

Le séquençage Illumina est une méthode de séquençage de nouvelle génération qui utilise une puce micro-fluidique pour générer des clusters d’ADN par amplification en pont (bridge amplification).

Cette technique repose sur l’incorporation de nucléotides terminators réversibles marqués par fluorescence, qui permettent de lire des millions de fragments simultanément, fournissant une séquence avec une grande précision.

58
Q

Comment l’échantillon d’ADN est-il préparé pour le séquençage Illumina?

A

L’échantillon d’ADN est fragmenté, puis des adaptateurs spécifiques (séquences courtes d’ADN) sont ligaturés aux extrémités des fragments. Ces adaptateurs permettent l’immobilisation des fragments sur une puce micro-fluidique, où ils se fixent par complémentarité avec des amorces fixées sur la puce.

59
Q

Qu’est-ce que l’amplification en pont (bridge amplification) et pourquoi est-elle utilisée dans le séquençage Illumina?

A

L’amplification en pont est une technique où chaque fragment d’ADN se replie pour se lier à une autre amorce proche sur la puce, formant ainsi une structure en boucle.

Cela permet à l’ADN de se dupliquer de manière locale, générant des clusters de fragments identiques. Cette étape est essentielle pour amplifier suffisamment le signal pour la détection.

60
Q

Quels sont les avantages de l’amplification en pont par rapport à d’autres méthodes d’amplification?

A

L’amplification en pont est plus précise et génère des clusters denses de fragments identiques, permettant une lecture parallèle massive. Elle minimise le bruit de fond et réduit le risque de contamination croisée par d’autres séquences, garantissant une grande précision dans la détection de chaque nucléotide.

De plus, Illumina offre une capacité de séquençage très élevée (haut débit) et un faible coût par base séquencée. Il permet de lire des millions de fragments en parallèle, réduisant considérablement le temps nécessaire pour séquencer de grands génomes par rapport à des méthodes comme Sanger.

61
Q

Comment les nucléotides terminators réversibles sont-ils utilisés dans le séquençage Illumina?

A

Les nucléotides terminators réversibles sont des nucléotides modifiés qui possèdent un groupe chimique empêchant l’ajout de nouveaux nucléotides (terminateur).

Chaque nucléotide est marqué par un fluorochrome spécifique, ce qui permet de détecter son incorporation par un signal fluorescent.

Les nucléotides terminators sont réversibles car le groupe chimique qui bloque l’incorporation de nouveaux nucléotides peut être clivé après détection. Cela permet de reprendre la synthèse au cycle suivant, contrairement aux didésoxynucléotides utilisés dans la méthode Sanger, qui bloquent de manière permanente l’élongation.

62
Q

Comment la fluorescence est-elle utilisée pour détecter les bases dans le séquençage Illumina?

A

Lors de chaque cycle de séquençage, un nucléotide fluorescent est incorporé dans le brin d’ADN en cours de synthèse. Une caméra à haute résolution prend une image pour chaque cycle, enregistrant la couleur émise par la fluorescence de chaque cluster. La couleur détectée correspond au nucléotide incorporé (A, T, C, ou G), permettant ainsi de lire la séquence.

63
Q

Quelles sont les étapes successives du séquençage Illumina après l’incorporation de chaque nucléotide?

A
  1. Incorporation d’un nucléotide terminateur réversible fluorescent.
  2. Détection du signal fluorescent par imagerie.
  3. Clivage du groupe terminator pour permettre l’incorporation du prochain nucléotide.
  4. Réinitialisation de la puce pour le cycle suivant. Ces étapes sont répétées pour chaque cycle de séquençage, permettant de lire la séquence nucléotide par nucléotide.
64
Q

Quelle est la capacité typique d’une plaque de séquençage Illumina?

A

Une plaque de séquençage Illumina peut contenir jusqu’à 8 puits, chaque puits pouvant accueillir environ 200 millions de fragments.

Avec une lecture de 50 paires de bases par fragment, cela permet de générer environ 80 milliards de paires de bases par séquençage.

65
Q

Qu’est-ce que la méthode de séquençage par nanopores et comment fonctionne-t-elle?

A

La méthode de séquençage par nanopores (e.g., MinION) permet de séquencer de longues molécules d’ADN ou d’ARN en faisant passer chaque molécule à travers un pore nanométrique dans une membrane.

Chaque base (A, T, C, ou G) est identifiée en fonction de la perturbation du courant électrique générée lorsqu’elle traverse le pore. Les modifications dans le signal électrique permettent de déterminer la séquence en temps réel.

66
Q

Quel est le rôle des protéines dans la méthode de séquençage par nanopores?

A

Une première protéine déplie la molécule d’ADN double brin en un simple brin.

Une seconde protéine maintient le brin simple dans le pore et régule son passage, permettant de lire chaque base individuellement en fonction de sa perturbation du courant électrique.

67
Q

Quels sont les avantages et les inconvénients du séquençage par nanopores par rapport aux autres méthodes de séquençage?

A

Avantages :
- Permet de lire des molécules d’ADN très longues, allant de plusieurs milliers à millions de paires de bases, ce qui réduit le besoin de fragmentation et d’assemblage de génomes.
- Peut séquencer en temps réel, est portable (comme avec le MinION), et ne nécessite pas de réactifs complexes, ce qui en fait une méthode flexible et rapide.

Inconvénients :
- Taux d’erreur plus élevé que d’autres technologies de séquençage de nouvelle génération. Les erreurs sont principalement dues à la difficulté de distinguer certains motifs répétés et à des variations dans le signal électrique.

68
Q

Comment la technologie Illumina diffère-t-elle de la technologie des nanopores en termes de séquençage?

A

La technologie Illumina séquence des fragments courts par des cycles d’incorporation de nucléotides fluorescents. Elle est extrêmement précise pour les séquences courtes mais nécessite un assemblage complexe pour les génomes longs.

La technologie des nanopores lit des molécules entières sans fragmentation, ce qui simplifie l’assemblage mais a un taux d’erreur plus élevé.

69
Q

Qu’est-ce que l’alignement de séquences et pourquoi est-il important dans l’analyse génomique?

A

L’alignement de séquences consiste à comparer des séquences d’ADN ou d’ARN à un génome de référence pour identifier les correspondances, les différences (mutations, délétions, insertions), et les isoformes. C’est une étape cruciale pour l’identification des gènes, l’analyse des variations génétiques et la compréhension de la fonction des régions régulatrices.

70
Q

Comment la cartographie des séquences est-elle réalisée après le séquençage?

A

Après le séquençage, les fragments d’ADN ou les molécules entières sont comparés à un génome de référence à l’aide de logiciels de cartographie.

Les fragments ou lectures (reads) sont alignés sur la séquence de référence pour identifier les régions correspondantes et détecter les variations génétiques.

Les isoformes des gènes peuvent également être identifiées en fonction de l’alignement des séquences d’ARN.

71
Q

Quels sont les types de données affichées par le UCSC Genome Browser et comment cet outil est-il utilisé?

A

Le UCSC Genome Browser affiche des annotations comme les gènes, niveaux de transcription, modifications d’histones, sites de fixation et variations génétiques, permettant d’explorer le génome humain et d’analyser la régulation génique. Les outils de visualisation génomique contextualisent l’ADN en montrant les régions codantes, non codantes, sites régulateurs, et modifications épigénétiques, facilitant l’interprétation des données génétiques.