INGENIERIA GENETICA Flashcards
definizione di PCR
reazione a catena della DNA polimerasi = è una tecnica che permette di amplificare un segmento specifico di DNA (minisatelliti/microsatelliti)
⚠️ la PCR è un esempio di clonazione (creazione di un DNA identico a quello di partenza)
quali sono gli “ingredienti” per la PCR?
-pezzo di DNA da amplificare
-2 primer (frammento di RNA) che fungono da innesco per la DNA pol
-taq polinerasi = DNA polimerasi di un batterio termostabile (resistente al calore)
-desossinucleotidi trifosfati (necessari per la sintesi di un nuovo DNA)
dimmi le fasi della PCT
1) denaturazione (95 gradi) della doppia elica = due filamenti paralleli
2) raffreddamento (50/60 gradi) = appaiamento dei primer alle estremità della sequenza di DNA
3) allungamento (65/70 gradi) = Taq polimerasi sintetizza un nuovo filamento a partire dai primer
tecnica del DNA ricombinante
manipolare + modificare sequenze geniche
DNA ricombinante: sequenza di DNA ottenuta unendo artificialmente due frammenti di DNA di origine diversa
dimmi che cos’è un enzima di RESTRIZIONE
è un particolare enzima che taglia il DNA in corrispondenza di una sequenza nucleotidica specifica
⚠️ EcoRI = enzima di restrizione = riconosce sequenze PALINDROMICHE (come tutti gli enzimi) + formazione di due frammenti corsivi
fasi della tecnica del DNA ricombinante
-taglio di brevi segmenti di DNA = enzimi di restrizione
-separazione dei segmenti attraverso elettroforesi
-identificazione del segmento di interessa mediante Southern blot
-moltiplicazione dei segmenti ottenuti tramite PCR
-studio della sequenza nucleotidica attraverso sequenziamento
-incorporazione dei segmenti d’interesse nel vettore grazie alla DNA ligasi
definizione di ELETTROFORESI
è una tecnica che permette di separare molecole elettricamente cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico
⚠️ nel caso dei frammenti di DNA (ottenuti con l’utilizzo degli enzimi di restrizione) si effettua la corsa elettroforetica sul gel di agarosio sfruttando le cariche negative dei gruppi fosfato dei nucleotidi
‼️è una tecnica che si basa sulla DIMENSIONE dei frammenti di DNA
caratteristiche dell’elettroforesi
-stampo rettangolare = contiene al suo interno un gel dove i frammenti di acido nucleico possono muoversi + presenza di pozzetti ad una delle due estremità
-DNA o RNA posti nei pozzetti (cavità)
-campo elettrico = il polo negativo (catodo) è vicino ai pozzetti, il polo positivo (anodo) all’estremità opposta
⚠️ i frammenti degli acidi nucleici (carichi negativamente) migrano verso l’anodo (polo positivo) con velocità differenti in base alla dimensione: i frammenti più piccoli migrano più velocemente di quelli con dimensioni maggiori
MEMOFRASE = gli ANioni (negativi) migrano verso l’ANodo (positivo)
definizione di southern blot
è una metodologia che identifica la presenza di specifiche sequenze di DNA tagliate dagli enzimi di restrizione e sperate con la corsa elettroforetica
fasi del southern blot
-denaturazione del frammento di DNA dopo l’elettroforesi
-trasferimento del DNA denaturato su una membrana di nitrocellulosa (lo scopo di questo passaggio è trattenere saldamente il DNA grazie alla nitrocellulosa carica positivamente)
-aggiunta di una sonda radioattiva costituita da nucleotidi marcati (di cui si riconosce la sequenza delle basi) = rilevazione della sonda marcata + identificazione della sequenza
dimmi 2 cose sui PLASMIDI?
-piccoli anelli di DNA presenti nel citoplasma dei batteri (elementi genetici mobili)
-sono differenti rispetto al genoma batterico = hanno una replicazione autonoma (duplicati e trascritti indipendentemente dal materiale genetico cellulare)
perché i plasmidi sono importanti?
1) dal punto di vista biologico = fattori F = geni codificanti proteine necessarie al processo della coniugazione batterica (processo con il quale una cellula batterica trasferisce porzioni di DNA ad un’altra tramite un contatto cellula-cellula) = scambio di plasmidi tra due cellule batteriche
2) dal punto di vista medico = fattori R (resistenza) = geni codificanti proteine che rendono il batterio resistente ad un determinato antibiotico (i plasmidi possono essere scambiati molto facilmente, favorendo una rapida diffusione della resistenza agli antibiotici in ambito ospedaliero
3) dal punto di vista biotecnologico = plasmidi = vettore ricombinante = inserire una sequenza di DNA all’interno di un plasmide iniettato nel batterio = replicazione del plasmide modificato
definizione di FAGI
batteriofagi (o fagi) = virus che infettano cellule batteriche per potersi replicare = vettori = con la tecnica del DNA ricombinante possono inglobate DNA esogeno e iniettarlo nel batterio nel processo di “infezione”
