Imunohistoquímica e estadiamento Flashcards
Para que serve a imunohistoquímica?
A imunohistoquímica é usada para detetar a presença de marcadores específicos de proteínas em membranas celulares, núcleo ou citoplasma. A deteção destes marcadores fornece informação sobre a morfologia e arquitetura da célula, sobre os mecanismos celulares, sobre a sinalização celular e sobre a localização de proteínas.
Quais são as principais áreas de aplicação da imunohistoquímica?
- Cancro
- Neurociências
- Descoberta de fármacos
A preparação de amostras histoquímicas sucede a coloração das amostras. Verdadeiro ou Falso?
Falso
Ordene os seguintes processos necessários à preparação de amostras imunohistoquímicas.
A. Antigen retrieval
B. Estabilização com o meio de montagem
C. Contra-coloração
D. Visionamento da coloração na MOC ou de Fluorescência
E. Desparafinização e rehidratação da amostra
F. Blocking
G. Coloração imunohistoquímica
E - A - F - G - C - B - D
Que substâncias estão envolvidas no processo de desparafinização e de rehidratação da amostra?
O xilol, o álcool e a água, por esta ordem.
Devido ao processo de fixação dos tecidos, os __________ dos antigénios podem estar inacessíveis por estarem ligados a ___________ das substâncias aí usadas, competindo, desta forma, com os ____________ de marcação.
epítopos; recetores; anticorpos
Quais são os dois métodos possíveis para fazer a recuperação dos antigénios?
- HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval): pH 6-9; a amostra é submersa num buffer (citrato, p.e) e aquecida durante cerca de 20 minutos a 100 ºC; método mais comum; muito sensível a pH, buffer usado, tempo e temperatura; demora mais tempo; recuperação tranquila dos epítopos (não há impacto na morfologia das células); ‘unequal retrieval due to unequal heating’.
- PIER (Proteolytic-Induced Epitope Retrieval): pH 7,4; usam-se peptidases (proteinase K, tripsina, pepsina, …) para quebrar a ligação do agente fixador ao epítopo; há incubação das amostras durante 10-30 minutos a 37 ºC com os peptidases; calibração da concentração é uma dificuldade; estas enzimas podem ter um efeito destrutivo nos tecidos.
O blocking minimiza a ligação _____________dos _____________. Pode ser ‘blocking non-specific ionic bindings’, onde há a ___________ do anticorpo de interesse em buffers com diferentes concentrações ___________, minimizando a sua ligação não-específica. Além disso, pode ser ‘endogenous enzyme blocking’, alguns métodos de _____________ usam substâncias ______________ nas células, pelo que é importante minimizar a interferência endógena no sinal detetado, usando-se, assim, soluções que bloqueiam ______________ a atividade das enzimas _____________ intervenientes.
não-específica; anticorpos; diluição; iónicas; coloração; presentes; especificamente; endógenas
Há dois métodos de coloração imunohistoquímica: o direto e o indireto. Descreva ambos.
Direto: O anticorpo, já marcado, liga-se diretamente ao antigénio. Este processo é rápido e simples, o sinal obtido é fraco a menos que haja elevada presença do antigénio e os anticorpos primários com marcação são caros.
Indireto: Liga-se um anticorpo primário reage com antigénio e há um anticorpo secundário (com marcação de fluorescência) que se vai ligar ao primário. Apesar de ser mais lento e complexo, permite que os anticorpos primários sejam mais específicos e que os secundários não tanto (mais barato, porque quer dizer que se pode ligar a mais do que um tipo de anticorpo primário). Além disso, permite que haja amplificação do sinal (the secondary antibody can bind at different antigenic sites of the primary antibody).
Os anticorpos monoclonais são mais baratos do que os policlonais. Verdadeiro ou Falso?
Falso
Os anticorpos monoclonais reagem com apenas ____ epítopo, reconhecem apenas ____ forma(s) de _____ proteína(s), a sua população é ________________ e são sensíveis a pH, tecidos e buffers.
1; 1; 1; homogénea
Os anticorpos policlonais reagem com ______________ epítopos, podem reconhecer proteínas com pequenas _____________ estruturais e são imunes a mudanças de pH, a diferentes tipos de tecido e buffers.
vários; diferenças
Quais são os tipos de marcadores que se podem usar na preparação de amostras imunohistoquímicas?
Cromogénicos (menos cores): DAB (castanho) e AEC (vermelho) podem ser convertidos por enzimas em produtos de coloração insolúveis; mais complexos; maior sensibilidade (pode haver amplificação do sinal através do método indireto da coloração imunohistoquímica).
Fluorescência (mais cores): apresentam fluorescência natural quando se ligam direta ou indiretamente aos antigénios (emitem luz com comprimentos de onda específicos quando excitados); mais simples; menor sensibilidade; melhor co-localização; higher dynamic range (easier to visualise rare and high abundant targets on the same slide).
Quais são as 3 formas de amplificação da deteção do sinal depois da aplicação de coloração com reagentes cromogénicos?
- ABC (Avidin-Biotin Complex): o anticorpo secundário é biotinado.
- Labelled streptavidin-biotin: igual ao ABC mas o tamanho do complexo é menor que este, facilitando a sua penetração nos tecidos. Além disso, a streptavidin não tem carga o que faz com que sejam minimizadas as ligações eletrostáticas (melhor sinal - 5 a 10x melhor que ABC).
- Métodos baseados em polímeros: mais simples e sensível de todos e conjugam-se os anticorpos secundários a marcadores em cadeias poliméricas.
No que é que consiste a contra-coloração?
Consiste na coloração adicional que permite obter informações morfológicas. Em análises cromogénicas, o mais comum é o H&E. Em análises de fluorescência, usam-se o DAPI e o FITC.
