Clinical Biochemistry - Analytical methods Flashcards
Na técnicas de espetroscopia, por que ordem aparecem as/os seguintes estruturas/intrumentos?
A) Detetor
B) Setor de comprimento de onda
C) Monocromador
D) Colimador
E) Fonte de luz
F) Amostra
E - D - C - B- F - A
Enuncie a Lei de Beer-Lambert.
A concentração de uma substância é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida a um certo comprimento de onda.
Quais são os objetivos da espetroscopia?
1) Determinar a concentração de um analito numa amostra.
2) Detetar impurezas.
3) Elucidar sobre a estrutura de compostos orgânicos.
4) Estudar a cinética (alterações das concentrações ao longo do tempo).
5) Detetar grupos funcionais e aceder ao peso molecular de uma substância.
A espetroscopia UV-Vis usa fontes de luz com comprimentos de onda entre __________ nm (grandes energias). Antes da análise, é necessário escolher o __________ adequado, de forma a que este não interfira com o espetro de absorção (para radiação UV, normalmente, usam-se cuvettes de _______). É importante também escolher o comprimento de onda de medida ou o intervalo de comprimentos de onda (para determinar o ______ ________ de absorção).
190-900; cuvette; quartzo; pico preferencial
Em testes de colorimetria, o tamanho das amostras e as suas alterações conformacionais podem causar alterações de cor. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
A colorimetria não pode ser um método quantitativo. Verdadeiro ou Falso?
Falso. Pode tornar-se quantitativa se for combinada com uma técnica de espetrofotometria.
A colorimetria permite aferir sobre alterações __________ e medir a concentração de analitos a um certo comprimento de onda.
conformacionais
A colorimetria permite aferir sobre a cinética das amostras em análise. Verdadeiro ou Falso?
Falso
A Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIS) usa fontes de luz com comprimentos de onda entre __________ nm (baixas energias, tal como o nome diz). As amostras podem ser ________ ou líquidas e esta técnica permire obter informação sobre a estrutura molecular, baseando-se na deteção de _________ atómicas.
1400-28000; sólidas; ligações
A espetroscopia de massa (MS) baseia-se na medida da razão massa-carga de cada analito através da sua ionização com feixes de eletrões. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
Em MS, os fragmentos são defletidos e separados de acordo com a sua razão massa-carga. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
A técnica de NMRS é pouco sensível. Verdadeiro ou Falso?
Falso
A técnica de Flow Cytometry baseia-se em fazer passar a amostra através de um feixe laser e a luz dispersa vai ser detetada e é caraterística de cada componente e tipo. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
Com a técnica de Flow Citometry, pode fazer a contagem de ________, a deteção de biomarcadores e a medida do tamanho do _________.
células; genoma
Na flow citometry, não é possível detetar-se fases do ciclo celular. Verdadeiro ou Falso?
Falso
A flow citometry, é preciso fazer-se a ___________ das amostras e esta é uma técnico muito ___________ e complexa.
coloração; específica
Na FACs, a separação das componentes é feita com base no uso de anticorpos altamente específicos marcados com corantes ___________ para distinguir entre tipos de células.
fluorescentes
A FACs permite fazer a separação com base em que caraterísticas das amostras?
- Tamanho;
- Granularidade;
- Expressão de citocinas.
(…)
As técnicas de cromatografia envolvem o uso de uma fase _______ (eluente) e de uma fase estacionária (fluido que enche o sistema analítico).
móvel
Na TLC (Thin-Layer Chromatography), a migração ocorre em placas de ______ ou em folhas de plástico com uma camada _____ de ________ finamente moído (sílica gel ou alumínio).
vidro; fina; adsorvente
Um elevado fator de retenção (Rf) é indicativo do quê?
Significa que um composto migrou uma grande distância na placa e é pouco polar.
Um baixo fator de retenção (Rf) é indicativo do quê?
Significa que um composto migrou uma pequena distância na placa e é muito polar.
Na TLC, torna-se possível excluir a hipótese de contaminação das amostras. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
Na técnica de SEC (Size-Exclusion Chromatography), as moléculas grandes (ou seja, que são _________ do que os buracos da matriz porosa) migram ____________ através da coluna. Já as pequenas (_________ que os buracos da matriz) equilibram-se com os líquidos interno e externo, migrando ___________ e emergindo do volume do _________.
maiores; rapidamente; menores; devagar; eluente
Na técnica de IEC (Ion-Exchange Chromatography), há a separação de iões e de moléculas polares ionizáveis através da sua afinidade para o _____ _________.
ion exchanger
Na IEC, a fase __________ é uma matriz fixa que contém grupos funcionais ionizáveis carregados que interagem com analitos de carga _______. Os analitos que não interagirem com a matriz ou que interagirem mais ___________ são os _________ a serem transportados. É, no entanto, preciso tomar atenção ao ponto isoelétrico do analito em estudo.
estacionária; oposta; fracamente; primeiros
A High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) envolve uma fase ______ que é bombeada por uma coluna que contém partículas porosas com uma segunda fase (______________) ligada à sua superfície. As diferentes ____________ das componentes da amostra nas duas fases fazem com que se movam a velocidades ____________ através da coluna. No fim, os componentes são detetados por espetroscopia de absorção.
móvel; estacionária; solubilidades; diferentes
Na HPLC, podemos ter uma fase normal, onde a coluna é ________ (sílica, p.e) e a fase móvel é ___________ (chloroform, p.e). É mais usada para elementos ‘water-sensitive’.
polar; não-polar
Na HPLC, podemos ter uma fase reversa, onde a coluna é _________ e a fase móvel é ___________. É a mais _________.
não-polar; polar; comum
Bolhas de ar no circuito dos analitos não são relevantes para o bom funcionamento da técnica de HPLC. Verdadeiro ou Falso?
Falso
A eletroforese consiste na migração de solutos ___________ num meio líquido (eletrólito) sob a influência de um ___________ ___________ aplicado. Existem 1 ________ e 1 cátodo e a separação resulta das diferentes __________ dos analitos (produto da mobilidade das partículas pela intensidade do _________ _________).
carregados; campo elétrico; ânodo; velocidades; campo elétrico
A eletroforese é usada para separação de DNA, RNA ou polipéptidos baseando-se no seu tamanho e carga elétrica. Moléculas mais _________ movem-se mais rápido e migram mais longe através dos _______ do ______ do que as moléculas ___________:
pequenas; poros; gel; grandes
Quais são os 2 tipos de testes bioquímicos analíticos que podem ser feitos?
- Moleculares: amplificam o material genético viral e amplificam o sinal. Detetam sequências de ácidos nucleicos, associados a agentes patogénicos ou marcadores genéticos.
- Serológicos (ou imunológicos): detetam anticorpos que se ligam a antigénios virais. Detetam-se anticorpos ou antigénios no sangue do paciente (ou noutro bioespécime).
Os testes serológicos permitem 3 grandes coisas. Quais são?
- Detetar anticorpos produzidos pelo sistema imunitário em resposta a uma infeção causada por um agente patogénico.
- Compreender a resposta imunitária após vacinação ou determinar possível exposição ao agente agressor.
- Deteção de anticorpos produzidos pelo sistema imunitário numa doença auotimune.
Os testes serológicos incluem…
- Testes de diagnóstico rápido (RDTs)
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
- Fluorescent immunoassays (FIA)
- Chemiluminescent immunoassays (CLIA)
- Western blot
- Testes de neutralização
- Testes de aglutinação
Os testes moleculares permitem 3 grandes coisas. Quais são?
- Detetam a presença de vírus, bactérias, fungos ou parasitas através dos seus ácidos nucleicos (diagnóstico rápido e de elevada sensibilidade).
- Identificam mutações genéticas, variações ou padrões de exposição génicas (podem estar associadas a determinadas doenças).
- Dão informação sobre a composição genética, fatores de virulência e de resistência à medicação.
Os testes moleculares incluem…
- Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
- Sequenciação de ácidos nucleicos
Qual é o princípio de deteção dos testes serológicos? E o dos testes moleculares?
Serológicos: respostas imunológicas (interação anticorpo-antigénio).
Moleculares: Amplificação ou deteção de ácidos nucleicos.
Os testes moleculares permitem fazer a deteção de atuais ou recentes infeções ou respostas imunitárias. Verdadeiro ou Falso?
Falso. Os serológicos permitem isso. Os testes moleculares apenas permitem detetar infeções atuais ou condições genéticas.
Ambos os tipos de testes bioquímicos (serológicos e moleculares) têm elevada sensibilidade. No entanto, um deles tem ambos os parâmetros maiores. Qual é?
Os testes moleculares.
Nos testes serológicos, quais são as fases do processo de deteção de anticorpos?
1 - Seleção do anticorpo/antigénio de deteção
2 - Imobilização do antigénio/anticorpo em microplacas
3 - Inoculação da amostra na microplaca (possibilitando a ligação entre os antigénios, se presentes, e os anticorpos da amostra)
4 - Lavagem da microplaca (remoção dos componentes não ligados)
5 - Deteção dos complexos antigénio-anticorpo, com ELISA, FIA e CLIA
6 - Medição do sinal para quantificação do anticorpo
Os RDTs podem gerar resultados em __________, usam tecnologia de ________ (como os testes de covid e de gravidez) e são muito usados em diagnóstico de doenças infecciosas (HIV, malária, infeções do trato urinário).
minutos; fluxo
Na ELISA, os anticorpos estão ligados a _________ para deteção de ____________ na amostra. Tem elevada sensibilidade e especificidade.
enzimas; antigénios
A ELISA é usada para diagnosticar doenças como a doença de _______, hepatite e alguns tipos de __________.
Lyme; cancro
Faça as correspondências corretas.
- ELISA Direta
- ELISA Indireta
- Sandwich ELISA
- Competitive ELISA
A. Existem anticorpos específicos para a molécula de interesse nos copos e são adicionados antigénios ligados a complexos enzima-anticorpos de competição. Se houver mais ligações entre o anticorpo do copo e o complexo de competição, quer dizer que a molécula de interesse está pouco presente e mais escura estará a amostra.
B. A molécula de interesse é diretamente imobilizada numa microplaca e liga-se diretamente ao um complexo enzima-anticorpo. É simples e rápido mas tem sensibilidade limitada.
C. Já existem anticorpos específicos para um epítopo no copo. Junta-se a molécula de interesse. Depois, entra o complexo enzima-anticorpo secundário. Tem uma especificidade e uma sensibilidade elevadas.
D. É semelhante ao método direto mas, neste caso, a enzima está ligada a um anticorpo secundário (menos específico —> mais barato). Junta-se um anticorpo primário específico e apenas depois o complexo. Permite que haja amplificação do sinal e apresenta elevada sensibilidade e é um método mais complexo, no entanto, mais flexível.
1 - B
2 - D
3 - C
4 - A
Quais são as fases básicas do processo de ELISA?
- Imobilização da molécula de captura.
- Inoculação da amostra.
- Diluição dos anticorpos de deteção.
- Adição de anticorpos marcados com enzimas (ligam-se a anticorpos primários).
- Adição de um substrato para catalizar enzimas após diluição e lavagem (retirar moléculas não ligadas).
- Análise com espetrofotómetros, fluoróforos ou leitores de microplacas.
Nas FIAs, os anticorpos são marcados com ______________ para deteção de antigénios na amostra. Tem elevada sensibilidade e especificidade. É usado para diagnóstico de doenças infeciosas, deteção de proteínas específicas e doenças autoimunes.
fluorescência
Nas CLIA, os anticorpos têm marcação _____________ para deteção de antigénios. A quantificação faz-se com base na _____ emitida na sequência de reações químicas. Oferece uma análise ___________ de elevada sensibilidade. É usado em diagnóstico de doenças infecciosas, testes ___________ e deteção de marcadores tumorais.
quimiluminescente; luz; quantitativa; hormonais
Compare os métodos de ELISA e de CLIA.
ELISA - métodos de deteção colorimétricos ou fluorescentes; elevada sensibilidade e mais barato.
CLIA - métodos de deteção com uso de PTM e/ou de câmeras de carga acopladas; melhor sensibilidade e mais cara.
O western blot é usado para detetar proteínas (presença, __________ e quantidade). Tem um sensibilidade média e, geralmente, oferece uma análise quantitativa.
tamanho
Quais são as fases que constituem o processo de western blot?
- Separação de proteínas (eletroforese) - PAGE
- Transferência para uma membrana (nitrocelulose, p.e)
- Staining (recorre-se a anticorpos primários e secundários marcados com enzimas, p.e)
- Gera-se o sinal para deteção em filmes radiográficos ou quimiluminescentes.
Os testes de neutralização avaliam a capacidade de uma molécula (agente neutralizador) afetar a atividade biológica de uma molécula alvo. A análise da atividade biológica pode ser estudada com base na viabilidade celular, citotoxicidade, replicação viral, atividade enzimática, etc. Geralmente, são usados para testar a ___________ de ___________ na prevenção de infeções ________, por exemplo.
viabilidade; anticorpos; virais
Os testes de aglutinação baseiam-se na aglutinação de células/bactérias/… na presença de determinados anticorpos/antigénios. Isto é, a ligação de anticorpos aos ____________ presentes nas superfícies destas partículas leva à formação de agregados que são facilmente ____________. São testes rápidos e simples e oferecem análises ___________ e semi-____________.
antigénios; observáveis; qualitativas; quantitativas
Quais são os tipos de testes de aglutinação mais comuns?
- Hemo-aglutinação: usado para testar o tipo de sangue e diagnosticar certas doenças infecciosas.
- Aglutinação de partículas: latex ou células microbiais são revestidas com antigénios e anticorpos. Quando estão na presença de amostras com antigénios e anticorpos, agregam-se. Usados para detetar anticorpos contra agentes patogénicos e doenças autoimunes.
- Aglutinação em lâmina: uma gota da amostra do paciente reage com um reagente específico presente na lâmina. Se o antigénio/anticorpo alvo estiver presente, ocorre aglutinação. É útil para identificar infeções bacterianas.
A PCR baseia-se na amplificação de segmentos específicos do DNA, recorrendo à replicação enzimática deste. A DNA ____________ sintetiza novas cadeias de DNA seguindo um _________ (é necessário porque esta enzima só consegue adicionar um _____________ na extremidade ___’ da cadeia). Usada para sequenciação de DNA, análise de __________ génica, testes _____________, análises forenses e diagnóstico de doenças infecciosas.
Polimerase; primer; nucleótido; 3; Polimerase; expressão; genéticos
Quais são as 3 fases da PCR?
- Desnaturação: separação da cadeias de DNA (altas temperaturas).
- Annealing: os primers (DNA or RNA single-stranded sequences of 20-30 bases) ligam-se às cadeias de DNA já separadas.
- Elongation: a temperatura volta a subir e as bases são adicionadas à extremidade 3´pela DNA Polimerase.
A RT-PCR permite a amplificação de segmentos de RNA através do uso da ____________ ___________ para converter RNA em DNA e aplicar a técnica de _______ depois.
transcriptase reversa; PCR
A RT-PCR é usada para avaliar a _____________ génica e fazer a deteção de __________.
expressão; retrovírus
A sequenciação de ácidos nucleicos permite determinar a ordem precisa das __________ dos nucleótidos, identificar doenças _____________ e compreender o risco de uma pessoa vir a desenvolver uma doença. É útil para fazer aconselhamento _____________, seleção de terapias e gestão de doenças.
bases; genéticas; reprodutivo
Quais são as 4 técnicas principais dos testes de sequenciação do DNA?
- Sanger (dideoxy sequencing): síntese de DNA com DNA Polimerase e com ddNTPs que interrompem a elongação. Os fragmentos interrompidos são separados por eletroforese e a sequência é determinada com base na ordem de terminação de eventos.
- NGS (Next Generation Sequencing): permite a sequenciação paralela de biliões de fragmentos de DNA simultaneamente.
- Sequenciação de RNA: provides insights into gene expression levels, alternative splicing, transcript isoforms and non-coding RNAs.
- Single Molecule Sequencing: directly sequence inidividual DNA or RNA molecules without the need for PCR amplification. These methods offer long-read sequencing capabilities, enabling the sequencing of complex genomic regions, structural variations and RNA isoforms.
Os testes de cultura (bacterial, viral, fungal, mycobacterial, parasitological and anaerobic) incluem o __________ e crescimento de microorganismos a partir de bioespécimes obtidas dos pacientes. Podem ser _____________ (meio de cultura é sólido - agar), líquidas (_____ comuns) ou ____________ (podem ser usadas células ____________ ou animais e são usadas para detetar alguns vírus como os adenovirujs e o herpes simplex virus, …).
cultivo; sólidas; celulares; humanas
Quais são os 4 princípios básicos do controlo de qualidade?
- Reliability;
- Consistency;
- Precision;
- Accuracy.
Accuracy + Precision + Consistency = Reliability
O controlo de qualidade pode ser __________ e ____________.
interno; externo
O controlo de qualidade interno envolve 3 pontos. Quais são?
- Regulação regulares (calibração de equipamentos, reagentes, etc);
- Amostras de controlo (Control charts - using standard samples to validate data, methods and equipment);
- Testes paralelos.
O controlo de qualidade externo envolve 2 pontos. Quais são?
- Comparação inter-laboratórios
- Participação em programas de testagem de eficiência (visited accredited organizations and regulatory agencies to assess the normal function of peer techniques and laboratories)
Quais são algumas boas práticas?
- Keep all documentation from quality control assessments;
- Ensure traceability of all the samples, processes and analysis.
A espetrofotometria UV-vis permite aferir sobre mudanças conformacionais e de cor das amostras. Verdadeiro ou Falso?
Verdadeiro
