Hoorcollege 3 - Moleculaire technieken en ontwikkeling

Question 1

In welke twee delen kan je moleculaire technieken opdelen?

Answer 1

Visualisatie en manipulatie categorieën

Question 2

Welke drie technieken gebruik je in de visualisatie categorie op DNA niveau?

Answer 2

Agarose gel, DNA-sequencing en Linkage-analysis

Question 3

Beschrijf waar je de agarose gel techniek (visualisatie categorie) precies voor gebruikt.

Answer 3

• Om te bekijken hoe groot DNA-fragmenten zin, wordt een agarose gel gebruikt om ze te scheiden. Voor fragmenten die groot zijn gebruik je een lage concentratie agarose, voor kleine fragmenten juist een hoge concentratie.
• Vervolgens wordt het DNA geladen in een opening (slotjes) en wordt er stroom opgezet. Het DNA is negatief geladen en migreert dardoor naar de positieve pool (anode).
• -> Kathode = negatief, anode = positief
• Met behulp van UV-licht kan het DNA zichtbaar worden gemaakt en kunnen er plaatjes van genomen worden. Na afloop kan er ook van het gewenste DNA-fragment een deel worden geïsoleerd (of weggesneden) voor verder onderzoek (denk aan kloneren of sequencing).

Question 4

Beschrijf waar je de DNA-sequentie techniek (visualisatie categorie) precies voor gebruikt.

Answer 4

• DNA-sequencing gebruik je als je wil weten wat de volgorde is van de nucleotiden in je DNA.
• Voor DNA-sequencing heb je radiactief geladen (dideoxy) nucleotiden nodig. Na de (at random) ingebouwde ddNTP kan geen nieuwe nucleotiden worden ingebouwd. Dus het label is de laatste nucleotide in het stuk DNA dat wordt geanalyseerd (sanger sequencing). Tegenwoordig gebeurt het met fluorescente labels die direct worden ingebouwd in het DNA, dit wordt ook wel next-generation-sequencing genoemd.
• Vervolgens wordt het poyly-acrylamide gel afgelezen van beneden naar boven. Het gekleurde piekpatroon geeft ook de volgorde weer.
• Sequencing wordt bijvoorbeeld gebruikt om mutaties te detecteren, zoals op het plaatje (?)
• g = genomisch DNA, c = copy DNA
• Voor genome-sequencing wordt het hele genoom van een organisme, wordt het DNA in random fragmenten gebroken. Deze worden vervolgens indivudeel geanalyseerd. Daarna worden de overlappende delen aan elkaar gepuzzeld en heb je de volledige sequentie.

Question 5

Beschrijf waar je de linkage-analysis (visualisatie techniek) precies voor gebruikt.

Answer 5

• Een andere manier om naar DNA te kijken is door middel van marker analyse ofwel linkage analyse
• -> Markers kunnen repeats in het genoom zijn (bijvoorbeeld TATATA), die variëren tussen personen. Markers kunnen ook Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) zijn, dus veranderingen op 1 nucleotide.
• De positie van de markers in het genoom is bekend Deze verschillen in markers tussen personen kunnen gebruikt worden om specifieke ziektebeelden te koppelen aan delen van een chromosoom. Dit gebeurt door het vergelijken van markers in gezonde en aangedane individuen in familie verband En wordt linkage analyse genoemd Recombinaties, die gebeuren in de zaadcellen en eicellen bij de meiose, beperken de chromosoom regio waar mutatie zich bevindt Tegenwoordig wordt deze methode minder gebruikt omdat direct sequencing nu veel efficiënter is dan vroeger.