Histopatologia Flashcards
1
Q
Etapy badań histopatologicznych
A
- Pobranie materiału
- Utrwalenie materiału biologicznego
- Przepajanie i zatapianie
- Cięcie na skrawki
- Wykonanie preparatów
- Barwienie
- Zamykanie preparatów
- Obserwacja mikroskopowa
2
Q
Jaki powinien być preparat?
A
- bardzo cienki (musi być częściowo przepuszczalny dla światła)
- trwały mechanicznie (zabezpieczony przed wysychaniem, kurczeniem, pękaniem)
- trwały biologicznie
3
Q
Rodzaje tkanek
A
- tkanka nabłonkowa
- tkanka łączna
- tkanka mięśniowa
- tkanka nerwowa
- (tkanka glejowa)
4
Q
Zasady pobierania materiału biologicznego
A
- zachowanie niezmiennej struktury tkanek
- pobranie reprezentatywnej części materiału biologicznego lub materiału z wielu sąsiadujących lokalizacji
- wygoda pobierania materiału
- szybkość przeprowadzania biopsji
- minimalizacja uszkodzeń organizmu
- pobranie minimalnej ale wystarczającej ilości materiału
- dochowanie starań, by materiał nie był zanieczyszczony
5
Q
Sposoby pobrania materiału
A
- wymaz - metoda nieinwazyjna
- biopsja - metoda inwazyjna
6
Q
Wymaz
A
- pobranie niewielkich fragmentów tkanek
- właściwie badanie cytologicznie
- wymaz przez złuszczanie samoistne (wydzieliny)
- wymaz przez złuszczanie wymuszone (szpatułką czy szczoteczką)
7
Q
Biopsja
A
- wymaga znieczulenia
- samodzielny zabieg lub śródoperacyjna
8
Q
Rodzaje biopsji (sposób pobrania)
A
- wycinkowa
- wycinająca
- aspiracyjna cienkoigłowa
- cienkoigłowa
- cienkoigłowa celowana
- gruboigłowa
- wiertarkowa (trepanacyjna)
- laparoskopowa
9
Q
Biopsja wycinkowa
A
Chirurgiczne wycięcie niewielkiego kawałka materiału biologicznego
10
Q
Biopsja wycinająca
A
Usunięcie całego fragmentu zmienionego chorobowo
11
Q
Biopsja aspiracyjna cienkoigłowa
A
Pobranie materiału cytologicznego, komórek nie tkanek
12
Q
Biopsja cienkoigłowa
A
Częściowo zachowany materiał biologiczny (strukturalnie)
13
Q
Biopsja cienkoigłowa celowana
A
Biopsja cienkoigłowa (aspiracyjna lub nie) + USG
14
Q
Biopsja gruboigłowa
A
Gruba igła, głębsze warstwy tkanki, więcej materiału, używa się pistoletu biopsyjnego
15
Q
Biopsja wiertkarkowa
A
Zwykle do kości
16
Q
Biopsja laparoskopowa
A
Źródło światła, kamera i niewielkie szczypce, najczęściej jama brzuszna
17
Q
Rodzaje biopsji (miejsce pobrania)
A
- endomiokardialna (cewnik przez żyłę szyjną przy wsparciu USG, można też przez żyłę udową
- biopsja stereotaktyczna mózgu
- biopsja szpiku kostnego
- biopsja przezskórna płuca (między żebrami)
- biopsja przezoskrzelowa płuca
- biopsja otwarta puca
- fetoskopia (od płodu)
18
Q
Utrwalanie
A
- zatrzymanie procesów biochemicznych i usztywnienie (utwardzenie) materiału do kolejnych badań
- tkanka zmienia swój wygląd: twardnieje oraz kurczy się lub rozciąga
19
Q
Co się dzieje gdy tkanki się nie utrwali?
A
- niekontrolowane odwodnienie
- działanie enzymów proteolitycznych (autoliza - rozkład enzymatyczny tkanek)
- działanie procesów gnilnych (rozkład przez drobnoustroje - głównie grzyby i bakterie beztlenowe)
20
Q
Utrwalanie - czynniki fizyczne
A
- głębokie mrożenie
- liofilizacja - usuwanie wody z materiału przez sublimację (gwałtowne chłodzenie, suszenie w próżni)
- wysoka temperatura (zazwyczaj wymazy)
21
Q
Utrwalanie - czynniki chemiczne
A
- wywołują koagulację - parowanie alkoholem/acetonem
- wywołują denaturację - uszkodzenie struktury przestrzennej białek
- tworzą mostki międzycząsteczkowe - formalina
22
Q
W jaki sposób utrwalacze działają na materiał biologiczny?
A
- addytywny - cząsteczki utrwalacza zostają wbudowane do utrwalonej tkanki
- nieaddytywny - cząsteczki utrwalacza nie pozostają w utrwalonej tkance
23
Q
Techniki utrwalania
A
- imersja (zanurzenie)
- perfuzja naczyniowa (metoda in situ)
24
Q
Utrwalanie: imersja
A
- np. zanurzenie w roztworze formaliny (i zakręcenie!)
- objętość utrwalacza powinna być 10/20-krotnie razy większa od mat. biol.
- osmolarność i pH utrwalacza i mat. biol. powinny być zbliżone
- idealne kawałki mają nie więcej niż 0,5 mm
W utrwalonej tkance powstają 3 strefy
- strefa zewnętrzna - najlepiej utrwalona (krucha tkanka)
- strefa środkowa - właściwa dyfuzja lub opóźniona (wczesne symptomy autolizy)
- strefa wewnętrzna - tkanka nieutrwalona, zniekształcona struktura tkanki
25
Utrwalanie: perfuzja naczyniowa
Zastąpienie krwi utrwalaczem przy zachowanym jeszcze fizjologicznym krążeniu
26
Utrwalacze chemiczne
- etanol/metanol
- aceton
- kwas octowy
- chlorek/siarczan cynku
- formalina
- aldehyd glutarowy
- tlenek osmu (VIII)
27
Utrwalacze: etanol/metanol
- kolagulacja i denaturacja
- nieaddytywny
- cząsteczki tłuszczowe ulegają rozpuszczeniu
- węglowodany zachowane
- za szybko odwadniają
28
Utrwalacze: aceton
- działa podobnie do alkoholu
- działa drażniąco na błony śluzowe
- używany do usuwania nadmiaru barwnika
29
Utrwalacze: kwas octowy
- częściowa koagulacja białek bez ich denaturacji
- dobrze konserwuje kwasy nukleinowe
- nie utrwala mitochondriów, błon i cytoplazmy
30
Utrwalacze: chlorek/siarczan cynku
- hamują działanie enzymów proteolitycznych
- słabe właściwości odwadniające
31
Utrwalacze: formalina
- najczęściej stosowany
- wodny roztwór formaldehydu
- na potrzeby mikroskopii optycznej
- zgodność z większością barwników
- nie polecana do obserwacji DNA bo wchodzi w reakcje z kwasami nukleinowymi
32
Utrwalacze: aldehyd glutarowy
- zazwyczaj używany z formaliną, mikroskopia elektronowa
- nie można go potem zatopić w parafinie
33
Utrwalacze: tlenek osmu (VIII)
- mikroskopia elektronowa
- łączy się ze związkami tłuszczowymi i nadaje im czarną barwę (utrwalenie i barwienie!)
34
Przepajanie
- substancja, która ma większą gęstość jest wprowadzana do wnętrza tkanki
- dzięki temu wszystkie przestwory zostają wypełnione
35
Zatapianie
- zatopienie w substancji o większej gęstości utrwalonego kawałka materiału
- tworzy się bloczek tkankowy
- używa się tej samej substancji, którą wcześniej przepajano
36
Po co utwardzać?
- większa gęstość daje możliwość cięcia na cieńsze skrawki (szczególnie istotne dla miękkich tkanek czy materiału z dużą ilością przestworów)
- cięcie bez zniekształcenia materiału
- ochrona mat. biol. przed czynnikami fizycznymi
- możliwość przechowywania nawet przez kilka lat
37
Substancja stosowana do zatapiania powinna być:
- obojętna chemicznie
- musi dobrze nadawać się do cięcia na skrawki
- nie może zaburzać struktury tkanek preparatu
- stabilna przez miesiące lub lata (archiwizacja materiału)
38
Najczęściej stosowane utwardzacze
- parafina
- żywica (epoksydowa lub akrylowa)
- żel agarozowy, żelatyna (przestrzenne struktury)
- inne: np. glikol polietylowy, nitroceluloza
39
Utwardzacze: Parafina
- wosk parafinowy to produkt rafinacji ropy naftowej
- białe ciało stałe w temp. pokojowej
- topnieje ok.40-65 stopni
- niereaktywna z innymi substancjami
- hydrofobowa
40
Wady parafiny
- nie nadaje się do bardzo twardych materiałów
- nie nadaje się do obserwacji tłuszczów
- nie nadaje się do cięcia skrawków do mikroskopii elektronowej
41
Jakie są substancje służące do przepajania i zatapiania materiału?
- hydrofobowe, nierozpuszczalne w wodzie
- błona jest hydrofobowa dlatego woda nie może wypłynąć z komórki
42
Dlaczego materiał musi zostać odwodniony przed zatopieniem?
- błona jest hydrofobowa dlatego woda nie może wypłynąć z komórki
- substancje przepajające mogą wniknąć do tkanek jeśli nie będzie tam wody
43
Kroki od utrwalania do utwardzania
1. Utrwalanie (usuwanie nadmiaru utrwalacza)
2. Płukanie
3. Dehydratacja
- alkohol - rosnące stężenie (usuwa wodę z tkanek)
- ksylen (rozpuszcza i usuwa alkohol)
- parafina (zastępuje ksylen)
4. Prześwietlanie (rozpuszczalnik- ksylen)
5. Przepajanie
6. Zatapianie
44
Przepajanie: procedura
- parafinę podgrzewa się o 2 stopnie wyżej niż jej punkt topnienia i zalewa się nią materiał
- zalany materiał zostawia się zwykle na godzinę w wygrzewarce (temp. jw.)
- proces powtarza się 3-krotnie
- na ostatnim etapie wyciąga się bloczek nie czekając aż parafina zastygnie
- trwa zwykle kilka godzin
45
Zatapianie
- materiał przepajany parafiną należy zabezpieczyć od zewnątrz
- materiał umieszcza się w formie i plastikowej formie
- zalewa się parafiną
- chłodzić gwałtownie
- bloczek gotowy do cięcia
46
Rodzaje krajalnic
- mikrotom
- wibratom
- ultramikrotom
- kriotom
- manualne
- połautomatyczne
47
Grubość skrawków zatapianych w parafinie
od 3 do 50 um cięte mikrotomem
48
Elementy mikrotomu
- nóż
- imadło (do przyciśnięcia bloczka)
49
Noże w mikrotomach
- metalowe (mat. zatopiony w parafinie, jednorazowe żyletki)
- szklane (do cięcia twardej tkanki lub mat. utrwalonego w żywicy)
- diamentowe/szafirowe (krojenie do mikroskopii elektronowej, najtwardsze)
50
Profile ostrzy
- profil A - bardzo ostry ale delikatny, idealny do miękkich materiałów, ciężko się ostrzy
- profil B - szybko ulega stępieniu, dobry do miękkich tkanek
- profil C - najczęściej stosowany, najbardziej uniwersalny, łatwo naostrzyć, pozwala na cięcie obiema stronami
- profil D - do bardzo twardych tkanek, nie ulega stępieniu
51
Kąt noża
- ok.10-15 stopni
- mniejszy kąt - nacisk na krojony materiał
- większy kąt - uszkodzenie preparatu
52
Rodzaje mechanizmów mikrotomu
- rotacyjny (z korbką)
- saneczkowy (do przodu i do tyłu, zazwyczaj to twardych tkanek)
53
Mikrotom mrożakowy
Miejsce kontaktu z mat. biol. jest chłodzone, przepływa przez niego zimna ciecz
54
Kriotom
Mikrotom zamknięty w kriostacie
55
Wibratom
- porusza się w kierunku preparatu ale i na boki
- świetne rezultaty dla bardzo miękkich tkanek
- i tak lepiej oblać tkankę żywicą dla lepszych efektów
56
Ultramikrotom
- cieńsze skrawki
- preparaty do mikroskopii elektronowej
- najtwardsze noże
- pod kontrolą mikroskopu optycznego
57
Czym są pokrywane szkiełka?
Substancjami adhezyjnymi, aby preparaty do nich równomiernie przylegały (np. białko jaja, skrobia, żelatyna
58
Jak nałożyć preparat parafinowy na szkiełko?
Skrawki umieszcza się w łaźni wodnej (ok.35 stopni), żeby się preparat rozprostował, czasem dodaje się niewielką ilość alkoholu
59
Jak przygotować preparat do barwienia?
Preparat wysycony parafiną (hydrofobowa) trzeba przygotować do barwienia barwnikami (hydrofilowe)
1. Deparafinizacja - ksylen
2. Rozpuszczenie ksylenu - szereg alkoholi
3. nawodnienie - woda (usuwanie alkoholu)
- alkohol odwadnia tkankę
- obecność wody w preparacie ułatwia równomierne wnikanie barwnika i przyspiesza proces barwienia
60
Barwniki chemiczne
- mają zdolność wiązania chemicznego
- pochłania fale świetlne o określonej długości
- zasadowe (kationowe)
- kwasowe (anionowe)
- obojętne (pH=7)
61
Jakie grupy funkcyjne zawiera barwnik?
- chromofor - odpowiada za nadawanie koloru
- auksochrom - odpowiada za połączenie cząsteczek barwnika z docelowymi cząsteczkami
- rodzaj i liczba auksochromów determinuje intensywność, nie nadaje koloru
- czasami używa się substancje pomocnicze np. sole metali jako pośrednika pomiędzy auksochromem a docelowym barwnikiem
62
Barwniki zasadowe
- np. hematoksylina (fiolet)
- mają powinowactwo do struktur o charakterze przeciwnym (anionowym, kwasowym), dlatego te struktury nazywa się zasadochłonnymi
- przykłady: DNA (jądra komórkowe), RNA (jądro), RER, jądro komórkowe
63
Barwniki kwasowe
- np. eozyna, oranż G, fuksyna
- barwią substancje kwasochłonne (aycydofile)
- przykłady: białka cytoplazmatyczne, błony komórkowe, włókna substancji pozakomórkowej (np. kolagenowe), mitochondria
64
Techniki barwienia
- progresywna (preparaty zanurzone w barwniku przez określony czas)
- regresywna (preparaty ulegają przebarwieniu, później się odbarwia, zazwyczaj bardzo stężone)
65
Barwienie hematoksyliną i eozyną (H+E)
- standardowe
- można poznać liczbę komórek żywych, kształt, układ komórek
66
Barwienie Nissla
- barwienie fioletem krezylowym
- fioletowo-niebieski kolor mają: jądra komórkowe, rybosomy, szorstka siateczka śródplazmatyczna, ciała komórkowe neuronów
67
Barwienie Golgiego
- srebrzenie
- wyłącznie niektóre komórki nerwowe oraz glejowe ulegają czarnemu zabarwieniu
- czarny: ciałka komórkowe neuronów oraz ich wypustki, naczynia krwionośne
- tło: beżowe
68
Barwienie Luxol Fast Blue
- wizualizacja osłonek mielinowych neuronów
- niebiesko-zielony: osłonka mielinowa
69
Barwienie Kluver'a-Barrery (KB)
- Luxol Fast Blue + fiolet krezylowy
- fioletowy: ciała komórek nerwowych (istota szara)
- niebieski: osłonka mielinowa (istota biała)
70
Barwienie Bielschowsky'ego
- zmodyfikowane barwienie Golgiego
- czarne: wypustki neuronalne
- Alzheimer: białka tau i złogi B-amyloidu
71
Barwienie PAS
- uwidocznienie węglowodanów
- czerowono-różowo-fioletowy kolor
- infekcja grzybowa
72
Barwienie trichromowe Massona
- 2 lub 3 barwniki (m.in hematoksylina)
- niebieski: kolagen i kości
- czerwony: włókna mięśniowe
- różowy: cytoplazma
- czarny: jądra komórkowe
- zawał mięśnia sercowego, dystrofia mięśniowa
73
Po barwieniu
- usuwanie nadmiaru barwnika
- dehydratacja
