HC.6: Next generation sequencing

Question 1

Opbouw genetische informatie

Answer 1

Nucleus –> chromosoom –> DNA –> nucleosome –> gen –> nucleotide

Question 2

DNA sequencing

Answer 2

Het bepalen van de volgorde van de 4 nucleotiden basen waaruit het DNA molecuul bestaat

Question 3

Polymerase Chain Reaction

Answer 3

Om DNA zichtbaar te maken moeten er veel meer extra kopieën gemaakt worden. Dit wordt gedaan door middel van PCR
1. Denaturatie: DNA smelt uiteen
2. Annealing: Binding van primers
3. Elongatie: Verlenging van primers

Question 4

Typen mutaties

Answer 4

Silent mutatie: codon verandert → aminozuur blijft hetzelfde
Missense mutatie: codon verandert → aminozuur verandert in een ander aminozuur
Nonsense mutatie: codon verandert → aminozuur verandert in een stopcodon

Question 5

Toepassingen DNA-sequencing in de oncologie

Answer 5

Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
Therapiekeuze (therapie A of B)
Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen)
Weefselidentificatie (weefsel van pt. A of B)

Question 6

Kenmerken Sanger sequencing

Answer 6

Mix van alle moleculen
1 fragment/analyse
Output max 1000 basen
Veel DNA nodig
Lage gevoeligheid
Poolen niet mogelijk
Eenvoudige analyse

Question 7

Stappen Sanger sequencing

Answer 7

1. Chain termination PCR using fluorescen ddNTPs
2. Size seperation and sequence analysis using capillary gel electrophoresis and fluorescence detection

Question 8

Kenmerken Next Generation Sequencing

Answer 8

Single molecule
Duizenden fragmenten/analyse
Output 1-20 x 10^9 basen
Weinig DNA nodig
Hoge gevoeligheid
Poolen van samples (barcode)
Bio-informatica vereist

Question 9

Next Generation Sequencing stappen

Answer 9

1. Library preparation
2. DNA library bridge amplification
3. DNA library sequencing
4. Alignment and data analysis

Question 10

Variant Allel Frequentie (VAF)

Answer 10

Hoe vaak een variant op een specifieke positie voorkomt ten opzichte van de referentie sequentie. Afhankelijk van:
- Gen
- Tumorcelpercentage

Question 11

Coverage (deep sequencing)

Answer 11

Aantal malen dat een base-positie bepaald is. Hoe hoger de coverage, hoe deeper gesequenced

Question 12

Whole Exome Sequencing (WES)

Answer 12

Sequencen van alle exonen van alle genen

Question 13

Whole Exome Sequencing (WGS)

Answer 13

Sequencen van het totale genoom