Golden Gate Cloning Flashcards
Kort, hva er prinsippet ved Golden Gate?
Prinsippet består av å bruke en type IIS-restriksjonsenzym og ligase i en restriksjonsligering for å sette sammen flere DNA-fragmenter i en definert lineær rekkefølge i en vektor, hvor alt forgå i et enkelt trinn.
Hva må til for at flere restriksjoner og ligeringer kan bli utført i samme reaksjonsmiks?
Alle overheng- og vektorpar må være unike og komplementære slik at annealing til neste fragment eller vektor kan forekomme.
Hva gjør type IIS-restriksjonsenzym?
Enzymet kløyver DNAet utenfor sekvensen for DNA-gjenkjenningsstedet.
For eksempel, gjenkjenningssetet til BsaI (GGTCTCN ↓ N1N2N3N4) består av en gjenkjenningssekvens (GGTCTC) og et kløyvingssete (↓) som fører til et enkelttrådet DNA-overheng bestående av fire nukleotider (N1N2N3N4) etter fordøyelse.
Hvilke egenskaper er viktig når man designer primere?
(1) Lengde på 18-24 baser
(2) 40-60% G/C-innhold
(3) Starte og ende med 1-2 G/C-par
(4) Smeltetemperatur (Tm) på 50-60C
(5) Primerpar burde ha en Tm innen 5C fra hverandre
(6) Primerpar burde ikke ha komplementære regioner
Hva er hensikten med PCR?
Hensikten med PCR (Polymerase Chain Reaction) er å selektivt amplifisere et spesifikt DNA-segment in vitro.
Hva er hovedtrinnene i PCR?
(1) Denaturering av dsDNA-templatet ved 92-95*C
(2) Annealing av primere ved 50-70*C
(3) Forlenging av dsDNA-molekyler ved omtrent 72*C
Disse trinnene blir gjentatt i 30-40 sykluser.
Hva er elektroforese?
Elektroforese er en teknikk for å separere DNA-, RNA-, og protein-molekyler basert på størrelse (gjennom porer i geleen) og elektrisk ladning.
Hva driver prøvene under en elektroforese?
Det brukes en elektrisk strøm for å bevege molekylene gjennom geleen. Ettersom DNA har en negativ ladning, vil de bevege seg mot den positive elektroden.
“The Monarch DNA Gel Extraction Kit” ble brukt under gel purification. Hvilke buffere inngår i kitet?
(1) Gel Dissolving Buffer
(2) DNA Wash Buffer
(3) MQ Water
Hvorfor utfører vi “gel purification”?
Vi utfører gel purification for å fjerne primer-dimere fra PCR produktet vårt. Primer-dimere er en vanlig artifakt i PCR-produkter, og dannes når to primere binder seg til hverandre istedenfor til DNA-templatet. Dette kan redusere effektiviteten av Golden Gate-reaksjonen hvis de ikke fjernes.
Hva er transformasjon?
Transformasjon er en primær teknikk i molekylær kloning for å produsere flere kopier av et rekombinant DNA-molekyl. Bakteriell transformasjon er en prosess hvor fremmed DNA blir introdusert i bakterielle celler, noe som resulterer i tilegnelse av nye genetiske egenskaper. Under transformasjon, blir DNAet - vanligvis i form av et plasmid - introdusert inn i en kompetent stamme av bakterier slik at bakteriene da kan replikere sekvensen av interesse i mengder som er passende for videre analyse og/eller manipulasjon.
Hva er de fire hovedtrinnene ved transformasjon?
(1) Forberedelse av kompetente celler
(2) Transformasjon
(3) Cellegjenopprettingsperiode (recovery)
(4) Utplating av celler
Hvilke to metoder er vanlig å bruke for å forberede celler for transformasjon?
(1) Heat shock:
Varmesjokk-transformasjon er også kjent som kjemisk transformasjon eller kalsiumklorid transformasjon. Denne metoden involverer å utsette cellene for plutselig økning av temperatur, ofte oppnådd ved korte dypp i varmt vann eller ved å plassere dem i en termoblokk, etterfulgt av en rask temperaturnedgang ved inkubering på is.
(2) Electroporation:
De høstede cellene blir gjentatte ganger vasket med iskaldt, deionisert vann ved pelletering og resuspensjon for å fjerne salter og andre potensielle forstyrrende komponenter. Etter 3-4 vaskesykluser, blir cellene pelletert og resuspendert i 10% glycerol for lagring.
Hva er resultatet av varmesjokk?
Cellemembranen blir mer permeabel, slik at opptaket av eksogent DNA blir lettere.
Hvordan foregår “cell recovery”?
Etter varmesjokk eller elektroporering, blir transformerte celler dyrket i antiobiotikafritt, flytende medium for en kort periode.
