CRISPR/Cas9 Flashcards
Hva er en PAM-sekvens?
“Protospacer adjacent motif” (PAM) er en kort DNA-sekvens (vanligvis 2-6 bp) som kommer etter DNA-regionen som er målet for kløyving av CRISPR-systemet. PAM er nødvendig for at en Cas-nuklease skal kutte, og finnes vanligvis 3-4 nukleotider nedstrøms for kuttestedet.
En annen kritisk funksjon ved PAM er at Cas-nukleasen vil lete etter den før den tvinner opp virus-DNAet for å kutte. Når Cas identifiserer korrekt PAM, vil den sjekke for å se om den oppstrøms regionen matcher gRNAet før den foretar redigeringen.
Hva er de to nøkkelmolekylene i CRISPR/Cas9-systemet?
Cas9 - som fungerer som et par av “molekylære sakser” som kan kutte de to DNA-trådene på en spesifikk lokasjon i genomet slik at biter av DNA kan bli satt inn eller fjernet.
Guide-RNA (gRNA) - som består av et lite stykke forhåndsdesignet RNA-sekvens (omtrent 80 baser) plassert i et lengre RNA-scaffold. Scaffold-delen binder seg til DNA og den forhåndsdesignede sekvensen veileder Cas9 til riktig del av genomet. Dette forsikrer at Cas9 kutter riktig del av genomet.
Hvordan ble CRISPR/Cas9 utviklet?
Noen bakterier har et lignende, innebygd, genredigeriingssystem som CRISPR/Cas9, som de bruker til å respondere til invaderende patogener. Bakteriene bruker CRISPR til å kutte ut deler av virus-DNAet og beholde det, slik at det kan hjelpe dem til å gjenkjenne og beskytte seg mot viruset neste gang det angriper.
Hvordan blir CRISPR-systemet anvendt for adaptiv immunitet hos bakterier?
Systemet utnytter Cas-nukleaser - enzymer son kan binde og danne DSBs i DNA. Når en bakterie blir infisert av et virus, bruker bakterien Cas-nukleasen til å kutte av en del av det virale DNA kjent som en protospacer. Dette fragmentet blir lagret i det bakterielle genomet sammen med fragmenter fra andre virus - som et immunminne. Disse virale spacer-fragmentene er plassert mellom repeterende palindromiske sekvenser, og det er dette arrangementet av spacere og palindromiske gjentakelser som har gitt CRISPR navnet sitt.
Hva står “CRISPR” for?
Clustered regularly interspaced palindromic repeats
Hvilke faktorer en Cas9-aktiviteten avhengig av?
Cas9 er avhengig av et CRISPR RNA (crRNA) og et trans-aktiverende CRISPR RNA (tracrRNA). crRNA er komplementært til den virale spaceren som ble lagret etter den originale infeksjonen, mens tracrRNA fungerer som et “scaffold”; disse to RNAene danner et kompleks kjent som guide-RNA (gRNA). Man kan tenke på Cas9 som en saks, og gRNA som hånda som bestemmer at saksen skal klippe.
Hva er CRISPR Gene Knockout?
Hvis Cas9 lager et DSB, vil det mest sannsynlig bli reparert av NHEJ. Imidlertid er NHEJ utsatt for feil, og det resulterer vanligvis i at innsettinger og slettinger (indels) i regionen repareres. Når indels forekommer i kodingsregionen og resulterer i en frameshift-mutasjon, blir genet ikke-funksjonelt. Dette er kjent som en “gene knockout” (KO).
Hva er CRISPR Knock-in?
I tilstedeværelse av DSB indusert av Cas9, kan celler også reparere seg selv via HDR, og denne reaksjonsveien tilbyr en mulighet for forskere til å sette inn et nytt stykke DNA eller et helt gen. Denne metoden er kjent som en “gene knock-in” (KI).
For å oppnå en “gene knock-in”, må det være et DNA-templat for reparasjon, kjent som en donormal. Dette donortemplatet består av sekvensen eller genet av interesse flankert av områder med homologi som matcher områder på hver side av kuttet.
Hva er Prime Editing?
Prime Editing involverer sammensmelting av nCas9 til en konstruert revers transkriptase og en “prime editing guide RNA” (pegRNA). pegRNA inneholder to seksjoner: en som veileder til regionen av interesse, og en annen som inneholder ønsket erstatning(er) for reparasjon etter at SSB er generert. Etter at en tråd har blitt endret av prime editor, kan den komplementære tråden også bli korrigert - et ytterligere gRNA og nCas9 vil dane en “nick” i tråden, og den vil bli reparert ved å bruke den tidligere redigerte tråden som templat.
Hva er Base Editing?
Base Editing bruker enten dCas9 eller nCas9. dCas9 kan ikke kutte DNA, mens nCas9 produserer “nicks” eller “single strand breaks” i DNAet. Ved å smelte sammen enten dCas9 eller nCas9 til et DNA-modifiserende enzym, kan forskere endre spesifikke nukleotider. En av begrensningene med Base Editing er at det ikke kan brukes for å endre alle mulige nukleotider, og dette er en av faktorene som førte til utviklingen av Prime Editing.
Hva er CRISPRa og CRISPRi?
Med noen små modifikasjoner, kan CRISPR/Cas9 også brukes til å regulere ekspresjon av gener.
Dette er kjent som CRISPR-aktivering (CRISPRa) og CRISPR-interferens (CRISPRi). CRISPRa brukes til å øke (oppregulere) ekspresjon av et gen, mens CRISPRi kan redusere (nedregulere) ekspresjonen av et gen.
Hva er hovedforskjellene mellom Base Editing og Prime Editing?
Base Editing:
- substitution mutations
- reliable, predictable, and efficient genetic outcomes
- it does not require template-based HDR
- avoidance of unwanted DSBs and large genomic rearrangements
Prime Editing:
- insertion and deletion mutations
- low error rates
- can mediate all four transition point mutations
- can mediate all eight transverse point mutations
- can insert up to 45 bps
- can delete up to 80bp
