DNA Sequencing Technologies Flashcards
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering er en målrettet sekvenseringsteknikk som bruker oligonukleotid-primere for å identifisere spesifikke DNA-regioner ved å forlenge DNA-sekvensen ved å bruke en blanding av nukleotider og fluorescerende markører.
Hvordan foregår en Sanger-sekvensering?
(1) Denaturering av DNA-dobbelttråden
(2) Enkelttrådet DNA blir “annealed” til oligonukleotid-primere og forlenget ved å bruke en blanding av dNTPs
(3) Sekvensen fortsetter å forlenges til det bindes en ddNTP
(4) Hver ddNTP har en fluorescerende markør, som en laser oversetter til en “peak”
Hva er forskjeller på dNTPs og ddNTPs i en Sanger-sekvensering?
dNTPs brukes for å bygge den nye dobbelttrådede strukturen. Sekvensen fortsetter å forlenges så lenge det bindes dNTPs, mens den stopper når det bindes en ddNTP.
ddNTPs har en fluorescerende markør som detekteres av en laser og oversettes til en “peak”, som forteller oss hvilken base det er.
Hva er Next Generation Sequencing (NGS)?
NGS er en ny teknologi for DNA- og RNA-sekvensering og variant/mutasjonsdetektering.
Hva er de ulike trinnene i NGS?
(1) DNA-fragmentering
Å bryte ned det ønskede DNAet til mange korte sekvenser.
(2) Forberedelse av bibliotek
Bibliotekforberedelse er en prosess hvor DNA-segmenter blir modifisert slik at hver DNA-prøve kan ha en prøvespesifikk indeks som prøveidentifikasjon som hjelper til med å identifisere pasienten som DNA-sekvenseringen ble utført fra. Denne prosessen gjør det også mulig å legge til sekvenseringsadaptere til segmentene.
(3) Sekvensering
Massiv parallell sekvensering utføres ved å bruke en NGS-sekvenserer. Biblioteket lastes opp i en matrise.
(4) Bioinformatisk analyse og datatolkning
Bioinformatikkanalyse er en prosess som involverer “base calling, read alignment, variant identification, and variant annotation”. Sekvensinformasjonen blir sammenlignet med en referansesekvens.
Hvordan foregår en Second Generation Sequencing?
En adapter binder seg til DNA-fragmentene, og binder fragmentet i en spesifikk posisjon i en flow cell. Alle fragmenter blir amplifisert, noe som resulterer i en klynge av identiske fragmenter. Deretter blir hvert fragment kopiert ved å bruke markerte nukleotider. Det tas bilder ved hver inkorporering av et nukleotid slik at man kan se fargen, og dermed bestemme sekvensen.
Hva er Whole-Genome Sequencing?
Whole-Genome Sequencing (WGS) er en omfattende metode for å analysere hele genomer. WGS utføres ved å bruke short-read NGS-teknologi. DNA blir fragmentert og sekvenseringsdata blir generert for hele genomet.
Hva er fordeler med WGS?
- Det gir en høyoppløselig, base-by-base-visning av genomet
- Fanger både store og små varianter som kan bli oversett ved målrettede tilnærminger
- Identifiserer potensielle årsaksvarianter for videre oppfølgingsstudier av genuttrykk og reguleringsmekanismer
- Leverer store mengder data på en kort tid for å støtte assembly av nye genomer
Hvordan fungerer eksom sekvensering?
“Whole Exome Sequencing” (WES) fungerer ved å bruke “capture probes” (syntetiserte nukleotider” eller agn designet for å spesifikt hybridisere eksonene, i stedet for å berike alt genomisk DNA.
Hva er Custom Targeted Gene Sequencing?
Med tilpassede design kan forskere rette seg mot regioner i genomet som er relevant for deres spesifikke forskningsinteresser. “Custom Targeted Gene Sequencing” er ideelt for å undersøke gener i spesifikke reaksjonsveier, eller for oppfølgingsveier fra genomomfattende assosiasjonsstudier eller WGS.
Hvilke to metoder finnes for målrettet sekvensiering?
(1) Target enrichment:
regioner av interesse blir fanget ved hybridisering til biotinylerte prober og deretter isolert ved magnetisk nedtrekk.
(2) Amplicon sequencing:
regioner av interesse blir amplifisert og renset ved å bruke svært multiplekse oligobassenger. Denne metoden tillater at forskere kan sekvensere opptil 2500 mål samtidig.
Hva brukes 16S rRNA Sequencing til?
Det er en vanlig amplikon-sekvenseringsmetode som brukes for å identifisere og sammenligne bakterier som er tilstede i en gitt prøve. Metoden kan også identifisere stammer som kanskje ikke kan bli funnet av andre metoder. Metoden brukes også for å studere fylogeni og taksonomi.
Hva er hensikten med ChIP-Sequencing?
ChIP-sekvensering brukes til å identifisere genomomfattende DNA-bindingsseter for transkripsjon og andre proteiner.
Hva skjer hvis man følger ChIP-protokoller?
Når man følger ChIP-protokoller vil man bruke et spesifikt antistoff som fører til at de DNA-bundne proteinene blir immunutfelt. Det bundne DNAet blir da samutfelt, renset og sekvensert.
Hvilke muligheter finnes ved ChIP-Seq?
Det muliggjør grundig undersøkelse av interaksjoner mellom proteiner og nukleinsyrer på en genomomfattende skala. Metoden kan også bli brukt til å kartlegge globale bindingsseter for et gitt protein.
