Gentechnik (VL5) Flashcards
1
Q
Wie wird ein Microarray hergestellt?
Wozu verwendet man ihn?
A
Herstellung des Microarray
- Zunächst braucht man die gesamte Genom Sequenz des zu untersuchenden Organismus
- Durch Computer Analysen ermittelt man die Positionen der Gene in der Sequenz
- Design von Primern, so dass man durch PCR Kopien der Gene herstellen kann
- Aufschmelzen der Doppelstränge in Einzelstränge
- Nun plaziert man Tropfen der einzelsträngigen DNA um geordnete Reihen auf einer Glasplatte zu erstellen
- Jeder Ort enthält mehrere Kopien der gleichen Sequenz
- Nun erstellt man eine Datenbank um die Orte der Gene zu dokumentieren
Funktion
- Man verwendet Microarray um die Unterschiede in der Genexpression zwischen zwei verschiedenen Zelltypen zu ermitteln
- Dafür wird die Art der mRNA in beiden Zelltypen verglichen
- Ein Microarray ist ein kleines Stück DNA
2
Q
Wie funktioniert ein Microarray?
A
Experiment mit Microarray
- Zuerst sammelt man die zwei unterschiedlichen Zelltypen die man miteinander vergleichen möchte
- Nun isoliert man die mRNA aus beiden Zelltypen durch Zentrifugation und das Anheften an Beads
- Als Nächstes wird eine cDNA Kopie der mRNA angefertigt
- Die beiden cDNA Proben werden nun zum Microarray hinzugegeben, wobei es zu einer Hybridisierung und Bildung einer DNA kommt, sobald sich 2 komplementäre cDNAs vermischen
- Die cDNA die nicht hybridisiert wurde wird ausgewaschen
- Als Nächstes untersucht man mit einem Scanner wo die jeweilige cDNA gebunden wurde
- Es kann auch DNA auf dem Microarray geben, die mit beiden Proben hybridisieren kann
3
Q
Wie funktioniert Next-Generation Sequencing?
A
Next Generation Sequencing
- Als erstes wird eine Probe entnommen und die DNA wird isoliert
- Nun wird die DNA in kleine Fragmente gespalten zb. durch Enzyme
- Als Nächstes werden 2 verschiedene Adapter in die Lösung gegeben, die jeweils an ein Ende der DNA Fragmente binden und die Fragmente werden amplifiziert und in Einzelstränge denaturiert
- Die Fragmente werden auf eine sogenannte Flow Cell gegeben, auf welcher 2 verschiedene Oligonukleotide angebracht sind, die die komplementäre Sequenz der Adapter haben
- Jedes Fragment bindet an einen der beiden Oligos
- Die DNA die an die Oligos bindet ist der Gegenstrang und nun wird der Leitstrang synthetisiert und der Gegenstrang weggewaschen
- Nun ist die gesamte DNA-Bibliothek (Fragmente) an die Flow Cell gebunden und wird amplifiziert um DNA Cluster zu bilden
- Als Nächstes binden die Stränge an ihrem freien Ende an ein weiteres Oligo und bilden so Brücken (Annealing)
- Nun wird erneut ein komplementärer Strang an den Einzelsträngen mittels einer DNA-Polymerase gebildet
- Die DNA wird wieder denaturiert, doch nun sind beide Einzelstränge an die Oligos der Flow Cell gebunden
- Dieser Prozess wird mehrfach wiederholt (Brücken Amplifikation)
- Nun werden jeweils die komplementären Stränge wieder ausgewaschen
- Für die Sequenzierung wird ein Primer, DNA Polymerase und mit 4 unterschiedlich fluoriszierenden Farbstoff markierten Nukleotide hinzugefügt
- Sobald ein Nukleotid am Strang bindet, wird die Farbe dedektiert (Read) und das nächste Nukleotid kann binden, so lange bis das komplette Fragment sequenziert wurde
- Als Letztes erfolgt die Datenanalyse, bei der die gesamten Reads überlappt werden und mit einem Referenz Genom verglichen werden
- Dadurch kann die gesamte Sequenz des Genoms ermittel werden
4
Q
Anwendungen von NGS
A
Für die Sequenzierung von
- Gesamtgenomen
- 1000 genome project
- RNA-Seq
- cancer genomics
- metagenomics
- microbiome
- environmental DNA seq
- single cell transcriptomics
5
Q
Was ist Proteomics? Technik? SILAC?
A
Proteomik
- umfasst die Erforschung des Proteoms, d.h. der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen vorliegenden Proteine
SILAC
- Stable Isotop Labeling of Amino Acids in Cell Culture
- Das Ziel von SILAC ist 2 Proteasomen anhand ihres Molekulargewichts zu unterscheiden
Funktionsweise
- Es wird je eine Zellkultur in einem Medium mit leichten AS und in einem Medium mit schweren AS gezüchtet
- Als Nächstes werden die gleiche Anzahl an Zellen jeder Kultur gemischt und lysiert
- Die Proteine jeder Zelle werden extrahiert und in Fragmente gespalten, die jeweils mit einem leichten oder einem schweren Arginin markiert sind
- Diese Markierungen können in der Massenspektrometrie erkannt werden und die Ratio der Masse zu ihrer Ladung kann ermittelt werden
- So können die leichten von den schweren Fragmenten durch ihr Molekulargewicht unterschieden werden
6
Q
Wie kann man die Funktionsweise vieler Gene im Genom untersuchen?
A
- Enhancer Trap
- GAL4/ UAS-System
- RNA Interferenz
