Gentechnik (VL4) Flashcards
1
Q
Wie funktioniert ein Southern Blot?
Welchem Zweck dient er?
A
Southern Blot
- Die zu untersuchende DNA wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt und anschließend durch Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt
- Die DNA-Fragmente werden in Einzelstränge gespalten und das im Gel entstandene Trennmuster auf eine Membran übertragen und dort fixiert
- Anschließend wird die Membran mit einer radioaktiv markierten DNA- Gensonde behandelt
- Befindet sich diese Sequenz irgendwo auf der Membran, so bildet die Sonde Basenpaarungen mit dieser aus
- Alle unspezifischen Bindungen werden anschließend abgewaschen
- Hybride werden durch Autoradiographie oder durch Färbungen erkannt
Zweck
- Nachweis eines DNA-Fragments in einem DNA-Gemisch
- Charakterisierung einer DNA-Sequenz in einem Gemisch durch Restriktionskartierung
2
Q
Was ist der Northern Blot?
A
Northern Blot
- beim Northern-Blotting wird zunächst RNA unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch nach Größe getrennt und dann durch Diffusion aus dem Gel auf Membranfilterfolie übertragen
- Diese wird dann in Hybridisierungsexperimenten mit den interessierenden Nukleinsäuren, die markiert sind, auf RNA-Fraktionen untersucht, die mit der markierten Nukleinsäure Komplementarität zeigen
Zweck
- Nachweis einer RNA in einem RNA-Gemisch mittels DNA- oder RNA-Sonde
3
Q
Was ist der Western Blot?
A
Western Blot
- durch Elektrophorese werden die Proteine ihrer Größe/ Form, Masse und Ladung nach aufgetrennt (SDS-Page)
- Die Proteine werden auf einen Membranfilter übertragen
- Jetzt wird ein spezieller Detektor (Antikörper) auf den Filter gegeben, der an das gesuchte Protein bindet
- Der primäre Antikörper bindet direkt an das Zielprotein
- Der sekundäre Antikörper kann an den primären binden und dieser ist nötig, um den gesamten Komplex zu detektieren zb. durch Chemilumineszenz
- Dafür entält der sekundäre Antikörper ein Enzym, welches bei Zugabe von Substrat ein Produkt und somit auch ein Detektionssignal produziert
Zweck
- Nachweis eines Proteins in einem Proteingemisch
4
Q
Wie stellt man Antikörper her?
A
Herstellung von Antikörpern
- Ein Antigen wird in einen Hasen injiziert und aktiviert dort die B-Zellen
- Die Plasma B-Zellen produzieren polyclonale Antikörper, die man aus dem Hasen extrahiert
5
Q
Wie funktioniert die Sanger-Sequenzierung?
A
Sanger-Sequenzierung
- der zu sequenzierende DNA-Strang wird erst amplifiziert und dann durch Erwärmung (Denaturierung) in seine Einzelstränge zerlegt
- Nun gibt man Primer, DNA-Polymerase und Nukleotide in die Lösung hinzu
- An einen Einzelstrang lagert sich nun ein komplementäres, kurzes Start-Molekül an (Primer)
- An den Primer bindet die DNA-Polymerase, die den Einzelstrang vervollständigt
- Dies geschieht solange bis die Polymerase ein Stopp-Nukleotid einfügt, dies geschieht zufällig
- Man erhält unterschiedlich lange DNA-Moleküle, die jeweil mit einem unterschiedlichen Nukleotid enden (G,T,C oder A)
- Mit einer Gelelektrophorese trennt man die Fragmente ihrer Größe nach auf, so dass sie sich um 1 bp unterscheiden
- Wenn man nun von unten nach oben die jeweiligen Stopp-Basen abliest, erhält man die Basenabfolge der Fragmente
6
Q
Was ist der Vorteil/ die Besonderheit von –omics Technologien?
A
- Durch alle diese Technologien können Biomarker identifiziert werden, die einen Hinweis auf eine bestehende Krankheit geben oder auf die Veranlagung einer Krankheit hindeuten
- Ausserdem kann eine Vorhersage des Behandlungserfolgs erfolgen
