Génétique moléculaire Flashcards
Comment synthétiser une cassette d’inactivation (3)
°Synthétiser régions 5’ et 3’ du gène d’intérêt via PCR mutagénique
°Insérer les deux bouts dans plasmide contenant gène de résistance à ATB et loxP
°Transformation bactérienne et isoler le fragment
Comment effectuer le knockout avec la cassette
°Transformation de la cassette dans la levure
°Double cross-over
°Remplacement d’allèle et excision/élimination de l’original
Comment isoler les levures ayant reçu le knockout
Étaler la levure sur un milieu contenant l’ATB
Recyclage de la cassette d’inactivation:
°Pourquoi?
°Comment (3)
°Pour refaire un autre knockout
°1) Transformation d’un plasmide contenant la CRE et ura4+ dans la levure
2) CRE induit une recombinaison homologue de loxP et ainsi l’expulsion de la cassette
3) Étalement sur un milieu avec 5-FOA pour expulsion du plasmide (ura4+ transforme 5-FOA en produit toxique)
3 façon de valider la réussite d’un knockout
°RT-PCR
°RNase protection (RPA)
°De façon fonctionnelle
RT-PCR:
°Les 6 ingrédients
°3 étapes
°Conclusions
°Transcriptase inverse, amorce sens, anti sens, amorce taq man, ARNm, polymérase
°1) Transcriptase inverse transforme ARNm en ADN
2) Liaison des 3 amorces si knockout fail
3) Polymérisation déplace taqman qui fait de la fluorescence
°Si fluorescence = gène intérêt encore la, si non = knockout réussi
RNase protection (RPA):
°3 étapes
°Conclusions
°1) Un ARN anti sens marqué va se coupler avec son brin homolgue
2) ARN non couplé va être dégradé par des RNase
3) Analyse sur gel acrylamide
°Si bandes = gène présent, si non = knockout réussi
Validation d’un knockout de façon fonctionnelle
ex: gène codant pour un pompe permettant l’entrée de fer dans la cellule
Mettre la cellule knockout en présence de fer et vérifier la présence de fer intracellulaire
°Prototrophe
°Auxotrophe
°Organisme capable de biosynthétiser un élément essentiel à sa survie
°Organisme incapable de biosynthétiser un élément essentiel à sa survie
°Pourquoi réintégrer gène d’intérêt +GFP (2)
°Comment (2)
°Restaurer phénotype ou perte de fonction et déterminer localisation cellulaire de la protéine
°Via simple cross-over (si déjà enlever) ou knockin (double cross-over)
Comment réintégrer gène d’intérêt +GFP via simple cross-over pour un organisme auxotrophe pour x (3 étapes)
*Le gène d’intérêt a déjà été enlevé
°Transformer dans la cellule plasmide contenant le gène + GFP + gène pouvant synthétiser x sans origine de réplication
°Simple cross over avec gène x inactif
°Étaler sur milieu sans x (si survie = ça la marché
Les 3 étapes pour effectuer un knockin de GFP (sans déjà avoir enlever le gène d’intérêt)
1) Substituer codon stop par un neutre dans l’ADN génomique
2) Créer une cassette avec 2 régions d’homologie, la GFP et un gène de résistance à ATB
3) Transformation et étaler sur milieu avec ATB
C’est quoi la synténie
Même gène dans le même ordre
Définition:
°Souris transgénique
°Souris knock out
°Souris qui exprime une ou plusieurs copie d’un gène qui a été intégré à l’intérieur de son génome de façon aléatoire (gain de fonction)
°Les deux allèles d’un gènes ont été délétés de façon précise par recombinaison homolgue (perte de fonction)
Souris transgénique:
°Comment
°3 désavantages
°Injection d’ADN dans le pronucléus d’un oeuf
°1) Pas tous les descendants qui hériteront du transgène
2) Le transgène ne doit pas interférer avec le développement embryonnaire
3) L’insertion du transgène peut produire des mutations
Souris knockout:
°À quel stade qu’on le fait
°Comment garder évènement recombinaison homologue
°4 étapes
°3 désavantages
°Cellules souches embryonnaire
°Si recombinaison non homologue les cellules auront le gène TK qui transforme le ganciclovir en proguit léthal
°1) Injecter cellules dans embryoblastes
2) Injecter embryoblaste dans souris porteuse
3) Croiser descendance lorsque mosaique
4) Croiser deux hétérozygote
°1) L’inactivation du gène peut ne pas produire de phénotype apparent
2) L’inactivation d’un gène peut être fatal
3) Les cellules souches peuvent variés d’une souris à l’autre
