Génétique moléculaire Flashcards

1
Q

Comment synthétiser une cassette d’inactivation (3)

A

°Synthétiser régions 5’ et 3’ du gène d’intérêt via PCR mutagénique
°Insérer les deux bouts dans plasmide contenant gène de résistance à ATB et loxP
°Transformation bactérienne et isoler le fragment

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2
Q

Comment effectuer le knockout avec la cassette

A

°Transformation de la cassette dans la levure
°Double cross-over
°Remplacement d’allèle et excision/élimination de l’original

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3
Q

Comment isoler les levures ayant reçu le knockout

A

Étaler la levure sur un milieu contenant l’ATB

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4
Q

Recyclage de la cassette d’inactivation:
°Pourquoi?
°Comment (3)

A

°Pour refaire un autre knockout
°1) Transformation d’un plasmide contenant la CRE et ura4+ dans la levure
2) CRE induit une recombinaison homologue de loxP et ainsi l’expulsion de la cassette
3) Étalement sur un milieu avec 5-FOA pour expulsion du plasmide (ura4+ transforme 5-FOA en produit toxique)

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5
Q

3 façon de valider la réussite d’un knockout

A

°RT-PCR
°RNase protection (RPA)
°De façon fonctionnelle

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6
Q

RT-PCR:
°Les 6 ingrédients
°3 étapes
°Conclusions

A

°Transcriptase inverse, amorce sens, anti sens, amorce taq man, ARNm, polymérase

°1) Transcriptase inverse transforme ARNm en ADN
2) Liaison des 3 amorces si knockout fail
3) Polymérisation déplace taqman qui fait de la fluorescence

°Si fluorescence = gène intérêt encore la, si non = knockout réussi

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7
Q

RNase protection (RPA):
°3 étapes
°Conclusions

A

°1) Un ARN anti sens marqué va se coupler avec son brin homolgue
2) ARN non couplé va être dégradé par des RNase
3) Analyse sur gel acrylamide

°Si bandes = gène présent, si non = knockout réussi

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8
Q

Validation d’un knockout de façon fonctionnelle
ex: gène codant pour un pompe permettant l’entrée de fer dans la cellule

A

Mettre la cellule knockout en présence de fer et vérifier la présence de fer intracellulaire

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9
Q

°Prototrophe
°Auxotrophe

A

°Organisme capable de biosynthétiser un élément essentiel à sa survie
°Organisme incapable de biosynthétiser un élément essentiel à sa survie

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10
Q

°Pourquoi réintégrer gène d’intérêt +GFP (2)
°Comment (2)

A

°Restaurer phénotype ou perte de fonction et déterminer localisation cellulaire de la protéine
°Via simple cross-over (si déjà enlever) ou knockin (double cross-over)

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11
Q

Comment réintégrer gène d’intérêt +GFP via simple cross-over pour un organisme auxotrophe pour x (3 étapes)
*Le gène d’intérêt a déjà été enlevé

A

°Transformer dans la cellule plasmide contenant le gène + GFP + gène pouvant synthétiser x sans origine de réplication
°Simple cross over avec gène x inactif
°Étaler sur milieu sans x (si survie = ça la marché

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12
Q

Les 3 étapes pour effectuer un knockin de GFP (sans déjà avoir enlever le gène d’intérêt)

A

1) Substituer codon stop par un neutre dans l’ADN génomique
2) Créer une cassette avec 2 régions d’homologie, la GFP et un gène de résistance à ATB
3) Transformation et étaler sur milieu avec ATB

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13
Q

C’est quoi la synténie

A

Même gène dans le même ordre

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14
Q

Définition:
°Souris transgénique
°Souris knock out

A

°Souris qui exprime une ou plusieurs copie d’un gène qui a été intégré à l’intérieur de son génome de façon aléatoire (gain de fonction)
°Les deux allèles d’un gènes ont été délétés de façon précise par recombinaison homolgue (perte de fonction)

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15
Q

Souris transgénique:
°Comment
°3 désavantages

A

°Injection d’ADN dans le pronucléus d’un oeuf

°1) Pas tous les descendants qui hériteront du transgène
2) Le transgène ne doit pas interférer avec le développement embryonnaire
3) L’insertion du transgène peut produire des mutations

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16
Q

Souris knockout:
°À quel stade qu’on le fait
°Comment garder évènement recombinaison homologue
°4 étapes
°3 désavantages

A

°Cellules souches embryonnaire
°Si recombinaison non homologue les cellules auront le gène TK qui transforme le ganciclovir en proguit léthal

°1) Injecter cellules dans embryoblastes
2) Injecter embryoblaste dans souris porteuse
3) Croiser descendance lorsque mosaique
4) Croiser deux hétérozygote

°1) L’inactivation du gène peut ne pas produire de phénotype apparent
2) L’inactivation d’un gène peut être fatal
3) Les cellules souches peuvent variés d’une souris à l’autre