Génétique 6 Flashcards
Introduction au diagnostic moléculaire
Combien de tests disponibles en ce moment?
Plus de 60 k
% de tests qui testent un panel de gènes?
10%
Que doit posséder un laboratoire diagnostic afin d’assurer la plus grande confiance dans les résultats?
- Formation
- Design du laboratoire
- Contrôles de qualité
- Programmes d’assurance de la qualité
- Accréditation
Décrit l’ADN.
nb de liens H, charge et constitution
Acide nucléique = sucre + phosphate + base
Charge négative (phosphate)
Liens hydrogène
* G-C : 3
* A-T : 2
Décrit la structure du gène, de gauche à droite.
- Promoteur
- 5’ UTR
- Codon d’initiation
- Exon (GT)
- Intron (AT)
- 3’ UTR
- Codon STOP
Savoir qu’il y a un motif/seq qui signale au debut et a la fin de chaque intron exon.
Fin d’exon?
GT
Début exon?
AG
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome non pathologique?
Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associée à une pathologie génétique
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome pathologique?
Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
Est-ce qu’on possède beaucoup de variations sur notre génome?
Oui, plus de 5-6 M
Est-ce que la plupart de nos variations sont pathologique?
Non
Que peuvent être les variations non pathologiques?
- Dans régions non codante
- Polymorphisme
- Touche un gène qui s’exprime seulement à l’état récessif et il n’y a pas une seconde variation
Les dinucléotides CG sont des endroits de prédilection pour les ________
mutations
Décrit la mutation la plus fréquente des îlots CpG
- C →methyl-C
- Methyl-C →U
- U→T
- CG → TG
Nomme les 3 types de variations selon la taille.
Grandes: CNV, LINE
Moyenne: microsatellites
Petites: SNP, indels
Que sont les microsatellites?
Répétition d’une petite séquence (ex: CA)
Que sont les SNP?
Changement d’un seul nucléotide
En quoi sont classés les petits réarrangement?
- Substitution
- Insertion
- Délétion
En quoi sont classés les substitutions?
Transition
Transversion
En quoi sont classé les insertions?
Mutation dynamiques
En quoi sont classés les grands réarrangements?
Insertion
Délétion
Équilibré
Quelle mutation est la plus fréquente?
Substitution
Nomme les 4 conséquences possibles des variations.
- Homologue (silencieux)
- Faux-sens (missense)
- Non-sens (nonsense)
- Altération du cadre de lecture (frameshift)
Homologue?
Change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé
Faux-sens?
Change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
Non-sens?
Change le codon pour un codon stop
Frameshift?
Insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une modification du codon et de ceux en aval
homonyme est elle pathologique ?
non de facon generale mais oui si cause un probleme lors de l’épissage / expression génique.
les variation faux-sens sont elles pathologiques ?
doit etre investigué !
les mutations non-sens et frameshift sont elles pathogeniques ?
oui et causent souvent les symptomes chez nos patients
Éléments à considérer pour évaluer le degré de danger d’une mutation?
- Fréquence population
- Conservation (au-travers des différentes espèces)
- Impact ARNm (changement de fct, séquestration d’autres prots et perturbation du fct cellulaire)
- Impact sur la protéine (altération d’un site enzymatique vs de liaison vs extra cellulaire)
- Fonction du gène (raisonner comme pour la prots)
Perte de fonction (souvent appelée haploinsuffisance)?
Une réduction dans la quantité de la protéine produite, ou une réduction de l’activité de la protéine, entraîne le phénotype
Gain de fonction?
Une augmentation dans la quantité de la protéine produite, une augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraîne le phénotype
Nomme les 5 mécanismes associés aux gains de fonction.
- Augmentation du dosage génique
- Altération de l’expression de l’ARNm
- Activité accrue de la protéine
- Nouvelle fonction de la protéine
- Altérations toxiques à la protéine
But de l’isolation génétique?
Isoler l’ADN du reste du contenu cellulaire (majoritairement protéines)
en se servant des caract. de l’ADN
Quelles cellules sont utilisées pour l’isolation de l’ADN?
Cellules nucléées (sang: leucocyte)
De quoi faut-il se servir pour isoler l’ADN?
Il faut se servir des caractéristiques spécifiques de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire
Nomme les deux technique qui permettent d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN.
- Densité optique
- Teintures intercalantes (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
Que fait la densité optique?
- λ 260nm = absorbance max ADN (280nm pour protéines)
- Estimation de la quantité de l’ADN (ratio 260/280 estime pureté)
À quoi servent les teintures intercalantes?
- Composés qui se fixent à l’ADN double brin
- Estimation de la quantité et de la taille de l’ADN par analyse bio-informatique le plus souvent.
De quoi est formé la sonde?
- Séquence d’ADN complémentaire à la régio d’intérêt
- Marquage (fluo, radioactif)
La détection du signal indique la présence de la _____________________.
séquence complémentaire
Qu’est-ce que l’électrophorèse capillaire?
On sépare les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (e.g. Agarose), ++gros –> ++lent –> – loin
Nomme une technique sur l’ADN génomique (toute tabarnak)
Buvardage Southern
Qu’est-ce que le buvardage Southern?
Technique qui combine électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par une sonde marquée complémentaire à l’ADN cible
Nomme les 5 étapes du buvardage de Southern.
A. Digestion de l’ADN génomique
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane
D. Hybridation et lavage
E. Détection par autoradiographie
Que permet de quantifier le buvardage de Southern?
Les grandes expensions (mutations dynamiques)
Nomme les composantes (6) de la réaction de PCR.
- ADN du patient
- Amorces
- Polymérase
- Nucléotides
- Tampon (ions, magnésium)
- Autres additifs si nécessaire
La PCR fait _________ la quantité d’ADN à chaque cycle
doubler
Que permet de détecter le PCR-migration?
Permet de détecter des insertions ou des délétions
cestun basic test en electrophorese ou on utilise la pcr pour avoir assez d’ADN
Qu’est-ce que le PCR migration?
- Électrophorèse capillaire des produits de PCR
- Détection du signal - la distance où se situe la bande par rapport au puits reflète sa taille (échelle de ref pour mesurer)
Applications du PCR migration?
Analyses d’identité génétique:
* Instabilité des microsatellites
* Contamination foeto-maternelle
* Judiciaire
Insertions et délétions récurrentes
migrationest processus recurrent
Qu’est-ce que le PCR digestion?
Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique
coupe là où motif désigné
Design du PCR digestion?
dans le cas ou on veut détecter une mutation
cela crer ou abolit un site de restriction et ensuite gel d’agarose pour taille des echantillons.
Exemples d’un PCR digestion?
- EcoR1 coupe à G_AATTC
- Dra I coupe à TTT_AA
Applications de la PCR digestion?
- Mutations ponctuelles récurrentes
- Il est habituellement possible de trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
d’abord on mix adn PCR-isé avec enz de R et on fait migrer sur gel d’agarose. Si on a une mutation, on aura juste 1 des deux brins brisés et l’autre non. Ainsi on peut calculer la proportion de mutation ponctuelle récurrentes d’un type donné.
Qu’est-ce que “Allele Specific Primer Extension”?
- Amplification PCR
- Jeu d’amorces marquées par fluorescence dont certaines ont mismatch 3’, i.e. représentant 2 allèles diff par exemple.
- Extension ssi match 3’
- Détection paranalyse de la fluroescence
Caractéristique de l’appareil pour le séquençage Sanger?
Appareil qui permet l’électrophorèse capillaire sur gel (polymère) et détection de fluorescence avec précision de 1 nuléotide
Étapes du séquençage Sanger?
- Amplification PCR
- Dénaturation
- Mélange de nucléotides normaux et de nucléotides modifiés qui sont marqués par la fluorescence et un blocage pour les appariements suivant.
Caractéristiques des ddNTP?
pas de -OH au C3 du ribose (chain termination donc pas d’ajout)
L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est __________.
aléatoire
Applications du séquençage de Sanger?
Cré des familles de chaines en inclusions strictes ou chacune se termine par un ddNTP.
- Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène (peut tout trouvé puisque capable de faire analyse par nucléotide)
- Méthode de choix pour substitutions (meme raison qu’en haut)
- Bonne méthode pour petites insertions ou délétions
- Ne détecte pas les grandes anomalies de dosage (grande deletion peut exclure la seq qu’on cherche et donc il n’y aura pas de polymerisation avec l’amorce car nul part ou se mettre)
Qu’est-ce que le PCR temps-réel?
Réaction de PCR avec détection du produit en simultanée
Possibilités du PCR temps-réel?
- Discrimination allélique
- Quantification (relative/absolue)
Décrit l’essai TaqMan.
- La sonde TaqMan est composée d’un “rapporteur” et d’un «quencher»
- La sonde se lie à l’ADN de même que l’amorce
- La Taq libère le rapporteur ce qui génère de la fluorescence
Décrit le PCR temps réel pour discrimination allélique.
- Amorce marquée
- Sonde marquée
- Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations
Décrit le PCR temps réel quantitatif.
- On fixe un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence (RFU))
- Ce seuil est le même pour tous les patients testés
- Comme dans la PCR la quantité d’ADN double à chaque cycle
Explique le résultat de ce scénario:
Échantillon 1, seuil atteint après 24 cycles (n)
Échantillon 2, seuil atteint après 25 cycles (n+1)
Puisque le nombre de molécules d’ADN double à chaque cycle, et que le seuil est le même pour les deux échantillons, il y avait 2X moins d’ADN dans l’échantillon 2 au départ (délétion ou bien pas d’allèle normaux etc)
À quoi sert MLPA?
Recherche de délétions ou duplications de 1 ou plusieurs exons
Méthode de MLPA?
- Sonde en deux sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient
- Ligase scelle ensuite les 2 sous-unités
- Amplification PCR
- Électrophorèse capillaire
***augmenter les proba de liaison en découpant en 2 brins
Que permet le SNG?
- Permet de multiplier l’information obtenue d’une analyse
- Possible d’analyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps en utilisant des code barre.
Comment fonctionne le SNG?
- Fragmentation de l’ADN
- Liaison d’adapteurs de séquencage et du code barre d’identification
- Capture :méthode utilisée pour isoler et enrichir des régions spécifiques de l’ADN ou de l’ARN d’intérêt dans un échantillon complexe, avant le séquençage
- Amplification en // i.e. PCR dans bule d’huile ou sur plaque ou sont fixés les fragments d’ADN.
- Séquençage en //
- Analyse bioinformatique
Décrit la partie d’analyse bioinformatique.
- Il faut procéder à l’alignement de ces séquences au bon endroit du génome humain
- Ensuite identifier si des variations de séquence sont présentes
- Ensuite déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
Le _% du génome qui contient les régions codantes
1
Nomme les deux applications du SNG.
- Exome (tres grand impact pour def intellectuelle)
- ADN foetal circulant
Décrit l’ADN foetal circulant.
- Produit par l’unité placentaire
- Courte taille
- Courte T½
- Variation absente chez la mère
*se trouve dans le plasma pour détecter dans syncytiotrophoblaste s’il y a du Y.
*permet aussi de détecter le rhésus de l’enfant pour voir si la mere est a risque de rejet.
*voir les trisomies
Qu’est-ce qui nous permet de reconnaitre le début d’un exon et d’un intron?
Des séquences particulières
Qui a la plus grande diversité d’allèle entre les microsatellites et le SNP?
Microsatellites
Quelle région a besoin d’avoir plus de triplets répétés pour être muté, exon ou intron?
exon
Vrai ou faux? Toutes les polymérases font des erreurs.
Vrai
Vrai ou faux? Toutes les polymérases ont le même taux d’erreur?
Faux
