genetika rastlín Flashcards
1
Q
evolúcia kukurice
A
- jedno miesto pôvodu - mexické/stredoamerické centrum
- domestikácia 9000 p.n.l.
- pôvodný druh teosinthe - výrazne lignifikované obaly, bohaté vetvenie
- kukurica stratila lignifikáciu aj vetvenie (apikálna dominancia)
2
Q
evolúcia pšenice
A
- kríženie planej jednozrnky (AA) a mnohoštetu 1 (BB) - vznik planej dvojzrnky (AABB)
- vznik kultúrnej dvojzrnky
- kríženie kultúrnej dvojzrnky a mnohoštetu 2 (DD) - vznik pšenice siatej (AABBDD)
3
Q
hlavné domestikačné znaky
A
- nerozpadavosť semien (vreteno klasu, nepukavosť listov)
- synchronizácia dozrievania
- minimalizácia dormancie
- jednoročnosť
-preferencia pre autogamiu - zmeny v chemickom zložení a kvalite užitočných orgánov
- bezsemenné plody
4
Q
gény domestikačných znakov kukurice
A
- Tga1 = teosynthe
- tga 1 = kukurica
- Tga 1 = tvorba pevného osemenia
- tga 1 = mutácia v promótorovej oblasti
- tb 1 = teosynthe
- Tb 1 = kukurica
- zvýšenie apikálnej dominancie
- TF rodiny TCF
5
Q
gény domestikačných znakov pšenice
A
- q = planá rastlina
- Q = pšenica
- rozpadavosť klasu, voľná obilka
- gén Q je pleiotropný (rozpadavosť klasu, pevnosť plevy, dĺžka klasu, výška rastliny)
6
Q
gény domestikačných znakov jačmeňa
A
- Vrs-1 = planá rastlina
- vrs-1 = jačmeň
- Vrs-1 = dvojradosť klasu
- vrs-1 = šesťradosť klasu
- u jačmeňa nedochádza k supresii laterálneho vetvenia
- vzniklo niekoľko na sebe nezávislých mutácií
- je to TF (leucínový zip)
7
Q
gény domestikačných znakov ryže
A
- Sh4 + qSh1 = gény podieľajúce sa na uvoľňovaní semien
- planá rastlina vystreľuje semená
- ryža nemá prepážku spôsobujúcu vystreľovanie
8
Q
evolučné mechanizmy ovplyvňujúce veľkosť genómu rastlín
A
- duplikácie
- delécie
- inzercie
- aktivita transpozónov
- prídavné chromozómy (B chromozómy)
- expanzia mikrosatelitov
- expanzia heterochromatínu (centromér)
- dôsledkom je redundancia génov
9
Q
B chromozómy
A
- väčšinou sú menšie a tvorené prevažne heterochromatínom
- obsahujú tandemové, centromerické, telomerické repetície, mini a mikrosatelity
- vysoké množstvo mitochondriálnej a chloroplastovej DNA
- nepárujú sa s A chromozómami
- dedia sa nemendelisticky, nondisjukciou
- je ich 2 - 8 na bunku, vyššie množstvo je asociované s neplodnosťou
- vznikli čiastočnou duplikáciou a prestavbou A chromozómov
- génová huba - zachovanie génov v evolúcii
10
Q
jadrový genóm
A
- kódujúce sekvencie
- nekódujúce sekvencie (repetitívne a mobilné)
- repetitívne: centroméry, teloméry, satelity
11
Q
gény kódujúce rRNA
A
- sú prítomné v repetíciách v oblasti “organizátor jadierka”
- jednotlivé gény sú oddelené prepisovanými medzerníkovými sekvenciami (vnútornými a vonkajšími)
- transkripčné jednotky sú oddelené neprepisovaným medzerníkom
- transkripčná jednotka sa prepisuje naraz a posttranskripčne sa upravuje
12
Q
gény kódujúce proteíny
A
- zásobné proteíny koreňov a hľúz
- enzýmy fotosyntézy
- stresové proteíny
- leghemoglobín (fixovanie dusíka)
13
Q
teloméry
A
- zaisťujú stabilitu chromozómových koncov
- u R to môže byť značná časť genómu
- špecifické repetície (TTTAGGG, TTAGGG)
14
Q
centroméry
A
- zodpovedné za primárnu konstrikciu chromozómu - segregácia
- tvorí ich repetitívny motív (30 - 140 bp, s celkovou dĺžkou až 1 Mb)
15
Q
DNA transpozóny
A
- schopnosť transpozície, ktorá je možná vďaka produktom týchto génov
16
Q
transpozóny Ac/Ds
A
- cut and paste
Ac (aktivátor) - autonómny
- 4,6 kb
- koncové obrátené repetície, ktoré sú nezbytné pre začlenenie do genómu
- gén pre transponázu
- cis element, ktorý rozpoznáva transponáza, pre excíziu
Ds (disociátor) - neautonómny
- nemá gén pre transponázu
- repetície zachované
- transponáza ho vyčlení a premiestni na iné miesto (napr. do iného génu, kukurica)
- väčšinou je jeden Ac na 10 - 20 Ds
17
Q
sfarbenie zŕn kukurice a transpozóny
A
- gén C kóduje fialové sfarbenie zrna
- môže sa do neho transponovať Ds a potom je zrno biele
- tiež sa môže Ds vyčleniť v priebehu vývoja semena, a tak vzniká škvrnité zrno
18
Q
transpozóny a gén waxy
A
- ak sa Ds začlení do blízkosti génu W, spôsobuje to chromozómové zlomy a stratu celého fragmentu s génmi colourless, shrunken, bronze
- tiež sa môže včleniť priamo do génu a vzniká mäkký endosperm
19
Q
mechanizmus transpozície
A
- párovanie koncových repetícii
- vyčlenenie
- párovanie s komplementárnymi oblasťami na inom mieste
- vytvorenie zlomov v inzerčnom mieste (lepkavé konce)
- začlenenie a dosyntetizovanie jednoreťazcového úseku
- ak sa transpozón vyčlení vznikajú duplikácie alebo neúplné duplikácie
20
Q
transpozóny u kukurice
A
- Ac/Ds
- Sp/m = En/I
- Mu
21
Q
transpozóny hrachu
A
- je s nimi asociovaný gén RUGOSUS (jeho produkt zabezpečuje vetvenie škrobu v endospermu)
- jeho inaktivácia má za následok zvráskavené semená (straty vody)
22
Q
transpozóny hledíka
A
- jedná sa len o Ac
- začlenenie do génov pre tvorbu antokyanov (pallida a nivea)
23
Q
heterológna transpozícia
A
- vnášanie transpozónov do druhov, kde sa nevyskytujú
- transpozónová inzerčná mutagenéza (inaktivácia, štúdium genómov)
- Ti plazmid (aktivátor v reportérovom géne - ak sa vyčlení pozorujeme prejav reportéru a hľadáme prejav transpozície)
- arabidopsis, ryža, tabak, paradajka, mrkva
24
Q
význam využitia transpozónov
A
- transpozónová inzerčná mutagenéza
- transpozónový tagging
25
retroelementy
- copy and paste
- abundantnejšie
- môžu sa kľudne niekoľkokrát kopírovať
- gén pre RT
26
retrotranspozóny Tyl-copia
- drozofila
- na oboch koncoch LTR
- v rámci LTR sú obrátené koncové repetície esenciálne pre začlenenie do genómu
- gény pre proteázu, integrázu, RT, a RNázu H
- gén Gag: štruktúrny gén podobný vírovým (znaky vírusov)
27
retrotranspozóny Gypsy
- podobné retrovírom
- obsahuje sekvenciu env pre obal vírusu
28
retrotranspozóny bez LTR
- potrebujú pomoc iného retroelementu
29
výskyt retroelementov u rastlín
- veľmi častý
- retrotranspozóny (Ty, copia, gypsy)
- retropozóny LINE
30
význam retroelementov u rastlín
- aktivované pri strese - adaptácia
- prispôsobenie sa podmienkam - speciácia
- zdroj regulácie a premenlivosti génov
- nástroj cieleného vnášania génov
31
čo vplýva na reguláciu génov u rastlín
- vývojový program (gény sú aktívne len v určitých pletivách a orgánoch)
- prostredie (gény sú aktívne na základe určitého podnetu)
32
orgánová a bunková regulácia
Knotted1 (kukurica) a Knat1 (arabidopsis)
- zachovanie meristému výhonu
- ak sa exprimuje v listoch (bežne sa tam nemá) tvorí hrbolčeky
- gain of function
33
rastlinné hormóny
- auxíny: delenie, predlžovanie, diferenciácia buniek
- cytokíny: delenie, rast buniek otváranie prieduchov, odďaľovanie starnutia
- giberelíny: rast rastliny, regulácia klíčenia a kvitnutia
stresové hormóny:
- kys. abscisová: vývoj a klíčenie semien, odpoveď na vodný deficit, prieduchy
- etylén: klíčenie semien, rast klíčnych rastlín, odpoveď na poranenie
34
regulácia génov prostredím - sucho
- rastlina má cudzorodý gén responzívny k suchu
- tento gén je fúzovaný s reportérom GUS (modrý produkt)
- ak je študovaný gén súčasťou kaskády reagujúcej na sucho, tak uvidíme modré sfarbenie v mieste expresie (napr. v prieduchoch)
35
regulácia génov prostredím - svetlo
- absorpcia svetla fytochrómami - konformačná zmena
- aktivácia génov aktivujúcich rbcS (RUBISCO)
- aktivácia génov fotosyntézy a kvitnutia
36
mechanizmus riedenia génovej transkripcie
regulačná oblasť
- antisense regulačná oblasť
- promótor:
- TATA box: väzba RNA pol a iniciácia transkripcie
- CAAT a ostatné boxy: regulácia RNA pol, väzba TF
37
elementy ARE u kukurice
- cis elementy promótora génu Adh-1
- aktivácia na základe nedostatku kyslíka
- aby sa mohla RNA pol naviazať, musia sa TF naviazať na ostatné boxy, jedným z nich je ARE
38
transkripčné faktory dôležité pre začiatok transkripcie
1. TBP
2. TFIID
3. TFIIB a TFIIA
4. nasadá RNA pol a TFIIF
5. TFIIH a TFIIE
6. začiatok transkripcie
39
funkcie chromatínu v génovej expresii
- ak je DNA v stave solenoidu, nemôže prebiehať expresia
- rozpletenie prostredníctvom histónovej acetyltransferázy
- zástava transkripcie deacetylázou
40
matrix attachement regions
- sľučkové domény chromatínu bohaté na domény AT
- sľučky tvoria menej kondenzovaný chromatín a transkripcia je prístupnejšia v oblastiach nahusteného chromatínu
- MAR obklopujú regulačné oblasti génov a podieľajú sa na ich regulácii
41
chloroplastová DNA
- cirkulárna DNA
- v mnohých kópiách
- 120 - 160 kb
- gény sú lokalizované v malej a veľkej sekvencii jednokópiových génov, oddelené sú invertovanou repetíciou
- gény pre replikačný aparát (tRNA, rRNA, ribozomálne proteíny)
- gény nezbytné pre fotosyntézu (rbcL)
- rôzny počet intrónov
- usporiadanie do operónov
42
mitochondriálna DNA
- viac subgenómových cirkulárnych štruktúr
- väčšia ako chloroplastová
- obrátené aj priame repetície (miesta rekombinácie, vznik subgenómových štruktúr)
- promiskuitné gény (obsahujú jadrové aj chloroplastové sekvencie)
- tRNA, rRNA, proteíny respiračného reťazca
43
koordinácia bunkových kompartmentov s jadrom - RUBISCO
- gény rbcS (jadrový) a rbcL (mitochondriálny)
- rbcS: mRNA putuje z jadra do cytoplazmy, vzniká proteín, transport do mitochondrie
- rbcL: v mitochondriách vzniká mRNA aj proteín
- zloženie podjednotiek v mitochondrii a vznik RUBISCO
44
transport proteínov do organel
- prostredníctvom chaperónov
- chaperóny prisadávajú na proteíny a udržiavajú ich v rozmotanom stave
- proteín prechádza cez póry membrány
- v organele sa zbaľuje
- proteíny určené do chp a mt sa syntetizujú na voľných ribozómoch
- signálna sekvencia je odstránená po doputovaní do chp, ak má v rámci organely cestovať ďalej je nutná ďalšia signálna sekvencia (napr. vnútorná membrána, stroma tylakoidu, v matrix)
45
proteíny kódované chp DNA aj jadrovou DNA a ich transport v rámci chp
proteíny z cytoplazmy:
1. sú transportované na vonkajšiu membránu chp
2. prechádzajú do stroma a zostávajú tam
3. sú transportované na tylakoidnú membránu
4. do vnútra tylakoidu
5. na jeho vnútornú membránu
proteíny syntetizované v chp:
1. stroma
2. tylakoid
46
mechanizmy transportu proteínov z cytoplazmy do chp
- pomocou chaperónov
- signálna sekvencia
- transportné aparáty: TOC a TIC
47
transport proteínov do mitochondrií
- v cytoplazme vzniká preproteín
- signálna sekvencia uchopená pomocou chaperonínov a pomocných proteínov
- transportné aparáty: TOM a TIM
48
chloroplastová RNA polymeráza
- 2 typy:
1. podobný prokaryotickej typu E. coli
2. kódovaný jadrovým génom a podobá sa RNA pol bakteriofágov T3 a T7 (len jedna podjednotka, záložná ak sa niečo stane s 1.)
49
rRNA chloroplastov
- 70S
- malá podjednotka (30S): 16S rRNA, 4 domény
- veľká podjednotka (50S): 23S a 4,5S rRNA, 6 domén
50
tRNA chloroplastov
- genetický kód nie je univerzálny
- malé rozdiely v sekvenciách v rámci jednotlivých sľučiek chloroplastovej a jadrovej tRNA fazule
51
zrelá chloroplastová mRNA
- jadrová: na 5' konci čiapočka a na 3' konci polyA
- chloroplastová: na 5' žiadna modifikácia, na 3' vlásenku (regulácia a stabilita)
52
funkčná genomika
- po sekvenácii genómu
- zaoberá sa určením funkcie génov
- projekt arabidopsis
53
nástroje funkčnej genetiky
- hlavne mutagenéza
54
klasická mutagenéza
- poznáme fenotyp a hľadáme genotyp
- kríženie mutantnú rastlinu so štandardnou (F1: dominantná/recesívna; F2: štiepne pomery)
- získanie sekvencie: genetické mapovanie (získanie mapy s dostatkom markerov), potom s pomocou pozičného klonovania približuje k hľadaniu génu
55
reverzná mutagenéza
- poznáme sekvenciu, hľadáme fenotyp
- na začiatku je sekvencia s hypotetickou funkciou
- porovnávanie s príbuznými genómami
- vytvorenie knižnice s inzerčnými mutantnmi
56
typy mutagénov
- chemické (priama genetika)
- fyzikálne (priama genetika)
- biologické (reverzná genetika) - T-DNA, transpozóny, retroelementy
57
inzerčná mutagenéza - T-DNA tagging
- infekcia bunky A. tumefaciens
- virG: TF, po kontakte s fenolickou látkou indukuje expresiu génov na Ti- plazmide
- virB: vytvorenie prechodového kanálika v bunkovej stene
- virD: viažu sa na hraničné sekvencie T-DNA a vytvárajú nick pre uvoľnenie ssDNA
- virE: stabilizácia ssDNA
58
použitie T-DNA pre transformáciu rastlinných pletív
- explantátové kultúry (semená, embryá, listové disky, korene)
- kokultivácia s baktériami
- regenerácia rastliny z buniek a pletív
- nevýhoda: veľká variabilita spôsobená pridávaním hormónov
- metóda vákuovej infiltrácie - bez explantátových kultúr, obmedzený počet druhov
markerové gény pre selekciu mutantných rastlín:
1. selektovateľné: atb R (neomycín transferáza, hygromycín transferáza), rezistencia k herbicídom (fosfinotricín - BAR)
2. signálne: GUS, GFP
59
identifikácia inerčných miest pomocou reverznej genetiky
1. inzerčná mutagenéza
2. vytvorenie knižnice inzerčných mutantov: tisíce rastlín pestovaných na plátoch, každá rastlina má inzert v nejakom géne, ale neviem v ktorom
3. izolujeme DNA z jednotlivých skupín rastlín (plat, radov, stĺpcov)
4. špecifická PCR: jeden primer pre inzert a druhý pre sekvenciu čo hľadáme, dôjde k amplifikácii u určitej skupiny (plato, rad, stĺpec)
5. klonovanie génu
60
izolácia rastlinného génu
- chceme identifikovať sekvenciu okolo inzertu
- v sekvencii inzertu sú restrikčné miesta
- restrikčné štiepenie v mieste inzertu a niekde v genóme
- ak má inzert ori - plasmid rescue, namnoženie v E. coli (získali sme polovicu našej sekvencie
- tá čo nemá ori - štiepenie RE aby sekvenciu záujmu obkľučovali sekvencie inzertu - návrh primerov a PCR
61
nešpecializované vektory
- vlastné promótory jednotlivých génov
- náhodné začlenenie
62
špecializované vektory
- pasívne: napravo je reportérový gén, bez alebo len s minimálnym promótorom, sledovanie fúznych génov
- aktívne: k pravej/ľavej hraničnej sekvencii je začlenený zosilňovač promótora 35S, aktivácia expresie génov, ktoré sú v určitých fázach ontogenézy umlčané
63
vymenuj špecializované vektory
- pasívne a aktívne
- pasca na gény
- pasca na regulačné sekvencie - promótory
- pasca na regulačné sekvencie - enhancery
64
pasca na gény
- reportérový gén bez promótora
- intrón v zavádzacej sekvencii
- začlenenie do intrónu rastlinného génu
- posttranskripčná úprava --> zostrih --> reportér sa dostáva pod riadenie rastlinného promótora a exprimuje sa spoločne s daným génom
65
pasca na regulačné sekvencie -promótory
- bezpromótorový reportér
- začlenenie do exónu a transkripčná fúzia
- expresia reportéru podľa promótora záujmu
- pozorovanie pletivovo a bunkovo špecifickej expresie
66
pasca na regulačné sekvencie - zosilňovače
- reportérový gén s minimálnym promótorom CaMV 35S
- začlenenie do exónu
- ak sa vektor začlení v blízkosti enhanceru, dôjde k expresii reportéra na detekovateľnú úroveň
67
výsledky inzerčnej mutagenézy - modelové druhy
- arabidopsis: veľké kolekcie inzerčných mutantov (až 180 tis.)
- ale u rastlín pozorujeme vysokú redundanciu
- niektoré mutácie letálne, alebo sterilné
- pravdepodobnosť detekcie špecifickej alely je 80 %
- asi 2000 génov doposiaľ nebolo zasiahnutých nijakou mutáciou
68
špeciálne typy vektorov
- vektory odvodené od Ti- plazmidu majú klonovaciu kapacitu asi len n10 kb
- pre prenos dlhších sekvencií bol vyvinutý BIBAC (binárny BAC)
- prenos až 300 kb DNA
- vnášanie génov pre odolnosť k patogénom a stresu
- využitie pri komplementácii (FILAMENTOUS FLOWER)
69
komplementácia
- overenie, že gén naozaj súvisí s pozorovaným znakom
- ak mutantnú rastlinu transformujeme štandardnou alelou a obnoví sa pôvodný fenotyp
- existujú knižnice komplementácie s wt alelami
70
inzerčná mutagenéza u kukurice
- vlastné retrotranspozóny: Huck, Ji, Opie, Zeon
- transpozóny: Ac/Ds, Mu
- hlavne transpozóny
- Mu je replikatívny
- 1. naklonovaný gén = BRONZE (syntéza antokyanov)
71
inzerčná mutagenéza u ryže
- transpozóny Ac/Ds
- T-DNA línia
- retrotranspozóny: Tos 17, Gaijin, Tourist
72
TILLING
- malý zásah do genómu
- dobové mutácie
- detekcia konkrétnych génov
- detekcia polymorfizmov v prírodnej populácii
- arabidopsis, kultúrne plodiny
- potrebujeme veľký súbor mutantov
1. zmiešanie DNA mutantov a štandardnej rastliny
2. amplifikácia génu záujmu
3. denaturácia a renaturácia - v jednej jamke dôjde k spojeniu mutantného a wt fragmentu = miss match
4. štiepenie duplexu restriktázou
5. v jamke vznikajú fragmenty o rôznej veľkosti
6. na géli je veľa produktov
73
homológna rekombinácia
- až tak sa nevyužíva, kvôli vysokému množstvu repetitívnych sekvencií
- T- DNA s komplementárnymi sekvenciami k cieľovému miestu
- môžeme použiť aj reportérový gén pre zviditeľnenie začlenenia
74
RNAi
- toto sa využíva hlavne
- umlčanie špecifických génov
- projekt AGRICOLA u arabidopsis
- vloženie špecifickej sekvencie vo forme obrátenej repetície oddelenej R intrónmi
- ak je začlenená dôjde k transkripcii a umlčaniu
75
porovnávacia genomika
- využitie známych genómov pre analýzu novo osekvenovaných genómov medzi príbuznými druhmi
- brassicaceae, solanaceae, poaceae, fabaceae, malvaceae
76
kolinearita
rovnaké usporiadanie lokusov u dvoch druhov
77
synténia
prítomnosť ortológnych lokusov na rovnakom chromozóme u rôznych druhov, ale môžu byť rôzne usporiadané
78
ortológia
rovnaké gény u rôznych druhov, ktoré pochádzajú od rovnakého predka
79
paralógia
gény, ktoré sa duplikovali u daného druhu, funkcia paralógnych génov sa v priebehu evolúcie môže odlíšiť
80
makrosynténia
konzervatívne usporiadanie génov v určitej oblasti chromozómov v rozsahu mnohých Mb, daná spoločným pôvodom
81
mikrosynténia
konzervatívne usporiadanie génov v oblastiach medzi makrosynténnymi génmi
82
