cytogenetika Flashcards
1
Q
cytogenetika
A
štúdium chromozómov (počet, morfológia, funcie, početné a štruktúrne aberacie, segrácia za normálnych aj patologických podmienok) + štúdium týchto nálezov s fenotypom
2
Q
čo objavil Mendel
A
- jednotky dedičnosti (gény) sú materiálnej povahy
- jednotky dedičnosti za nemiešajú (zákon segregácie)
- jednotky dedičnosti sú párové a sú dvojakého charakteru (dominantné a recesívne)
- dedičné jednotky sa prenášajú do ďalšej generácie pomocou pohlavných buniek
- u heterozygota sa dve alely v priebehu tvorby gamét od seba oddeľujú (segregujú)
- alely rôznych génov sa kombinujú nezávisle na sebe (zákon o voľnej kombinovateľnosti)
3
Q
Mendelove pokusy
A
- použil viac ako 27 tis rastliniek hrachu
- pokusy vykonával v rokoch 1854-1863
- prezentoval ich 8.2. a 8.3. 1865 na zasadaní Prírodovedeckého spolku v Brne
- publikácia v roku 1866
4
Q
prvé pozorovania chromozómov
A
- Nageli pozoroval vlaknité útvary v bunkách rastlín
- Flemming pozoroval mitózu u ľalií a mloka
- Hartz použil názov “chromo soma”
5
Q
chromozómová teória dedičnosti
A
- chovanie chromozómov počas mitózy opisuje princípy segregácie a voľnej kombinovateľnosti génov (Boveri a Sutton)
- TH Morgan preukázal na pokusoch s drozofilami (mutácia white na chromozóme X), že gény sú na chromozómoch (tiež vysvetlil väzbu génov)
- teóriu definitívne preukázal Bridges
6
Q
chromozómy a genetická diverzita
A
- segregácia, kombinácia a rekombinácia génov
- tvorba geneticky rozmanitých buniek
- príčinou je správanie chromozómov v meióze
- počet rôznych kombinácií chromozómov na úrovni gamét je 2^23, na úrovni zygóty je to 2^46 kombinácií + rekombinácia (spolu je to asi 6x10^46)
7
Q
štruktúrna variabilita genómu
A
- CNV (1 kb - 5 Mb)
- delécie, duplikácie, triplikácie, inzercie
- ale existuje aj prirodzene sa vyskytujúci copy number polymorphism (odlišnosť 2 jedincov je cca 20 Mb)
8
Q
počet chromozómov hrachu siateho 2n
A
14
9
Q
počet chromozómov arabidopsis thaliana 2n
A
10
10
Q
počet chromozómov pšenice obecnej 2n
A
42
11
Q
počet chromozómov drozofily 2n
A
8
12
Q
počet chromozómov včely 2n
A
16, 32
13
Q
história cytogenetiky
A
- 1950 náhodný objav hypotónie - bunky naboptnajú a chromozómy sa od seba vzdialila a sú lepšie pozorovateľné
- 1956 správne spočítanie (2n = 46) Tjio a Levan
14
Q
podmienky rozvoja cytogenetiky
A
- zdokonalenie techník kultivácie buniek in vitro
- použitie hypotónie (0,075 M KCl)
- zavedenie techniky roztlakov
- využitie kolchicínu
- farbenie 1 % orceínom
- zavedenie mikrofotografie pre účely dokumentácie
15
Q
objav prvej chromozómovej abnormality
A
- 1958
- Jerome Lejeune
- Downov syndróm 47, XX/XY (+ 21)
16
Q
Cri du chat
A
- delécia 5p
- môžu byť potomkami prenášačov s translokáciou
- PMR, srdcové vady, typický krik, hypotónie, hypotrofia
17
Q
Klineferterov syndróm
A
- 47, XXY
18
Q
Patauov syndróm
A
- 47, XX/XY (+ 13)
19
Q
Edwardsov syndróm
A
- 47, XX/XY (+ 18)
20
Q
Turnerov syndróm
A
- 45, X
21
Q
klasifikácia chromozómov
A
- denverská konferencia (1960)
- triedy A - G
22
Q
Filadelfský chromozóm
A
- translokácia medzi dlhým ramienkom chromozómu 22 a dlhým ramienkom chromozómu 9
23
Q
prvý prečítaný chromozóm
A
- 22
24
Q
chromozómy s najvyššou hustotou génov
A
- 19 a 22
25
chromozómy s najnižšou hustotou génov
- 13 a Y
- ale tiež málo majú 8, 18 a 21
26
klinické indikácie pre vyšetrenie karyotypu človeka
- promblémy skorého rastu a vývoja
- narodenie mŕtveho plodu a úmrtie novorodenca
- problémy s fertilitou, opakované aborty
- rodinná anamnéza
- tehotné ženy s komplikáciami (vek, pozitívne biochemické a ultrazvukové nálezy)
- nádorové ochorenia
27
čím sa zaoberá laboratórium prenatálnej diagnostiky
- vyšetrenie karyotypu z amniocytov, choriových klkov, placenty, tiež z kožných fibroblastov plodu
- a tiež vyšetrenie karyotypu potratených plodov
28
čím sa zaoberá laboratórium postnatálnej diagnostiky
- stanovením VCA a ZCA
29
čím sa zaoberá laboratórium nádorovej cytogenetiky
- vyšetrenie karyotypu z kultivovaných buniek kostnej drene alebo nádorov
- vyšetrenie prognosticky významných chromozómových zmien
30
použiti mikroskopu v cytogenetike
- svetelný mikroskop
- fázový kontrast (nefarbené preparáty)
- fluorescenčný mikroskop (FISH)
31
najčastejšie fluorochrómy používané v cytogenetike
- AMCA (modrá)
- FITC (zelená)
- TRITC (červená)
- Texas Red
- Cy3 (červená)
- Sprectrum Orange
- Spectrum Green
- Spectrum Aqua
farbenie pozadia
- DAPI
- HOECHST
- PI
32
svetelné zdroje fluorescenčného mikroskopu
- ortuť
- xenón
33
fluorescenčný mikroskop
- flitračná kocka: emisných filter, excitačný filter, dichroické zrkadlo
- zdroj svetla
- okulár, objektív
34
dichroické zrkadlo
- odráža krátlovlnné žiarenie
- prepúšťa dlhovlnné žiarenie do objektívu
35
typy filtrov do FM
- jednopásmové (zobrazuje len jednu farbu)
- dvojpásmové (zobrazuje dve farby súčasne)
- trojpásmové (tri farby)
36
úzkopásmové filtre
- používame, keď je preparát farbený viacerými fluorochrómami
- je nutné presne odlíšiť jednotlivé farby
- napr. M-FISH
37
nevýhody FM
- photobleaching (výber fluorochrómu s minimálnym fadingom, zníženie intenzity excitovaného svetla, poižitie antifadeu
38
typy kamier pre mikroskopu
- digitálne
- založené na CCD čipu
- farebné vs. čiernobiele
- monochromatické (snímanie obrazu v cytogenetike je vždy čiernobiele)
39
snímanie obrazu FM
- snímanie obrazu po farbách
- integrácia a vytvorenie farebného obrazu
- úprava snímky
- popis snímky
40
optický mikroskop časti
- mechanická časť: statív, makrometrický a mikrometrický štoub, tubus (binokulárny alebo trinokulárny), stolček, objektivový revolver
- osvetlenie: svetelný zdroj, kondenzor, zrkadlá, irisové clonky
- optické časti: okuláry, objektívy
- príslušenstvo pre FM: svtelná kocka - ortuťová výbojka a emisné a excitačné filtre
- príslušenstvo pre fázový kontrast: kondenzory a objektívy PHACO, pomocný okulár
- môže mať CCD kameru a farebný monitor
41
dôvody použitia imerzného oleja
- predchádza stratám svetla
- do objektívu dopadne väčšie množstvo paprskov
- imerzné objektívy zachytia viac detailov
- má vysokú hodnotu N (index lomu = optická hustota)
42
aký obraz sa tvorí v mikroskope
- zdanlivý, zvetšený, prevrátený
43
vady šošoviek
- farebná vada (obrazy pre rôzne farby sú rôzne veľké)
- guľová vada
- astigmatická vada
- vyklenutie zorného poľa
- vady sú odstránené buď kombináciou okulárov a objektívov alebo už konštrukčne (plan-apo)
44
typy objektívov
- achromáty (korekcia farebnej vady a čiastočne guľovej vady)
- fluorority (korekcia farebnej a guľovej vady)
- apochromáty (farebná vada je korigovaná pre tri farby)
- planachromáty a planapochromáty (odstránené vyklenutie zorného poľa, vhodné pre digitálne zobrazovacie metódy)
- širokouhlé objektívy (korigovaná farebná vada a vyklenutie zorného poľa, väčšie zorné pole)
- tiež sa môžu rozdeľovať na suché (NA<1) a imerzné (NA>1)
45
typy okulárov
- Huygensov
- kompenzačné (s apochromátmi)
- periplanatické (s planachromátmi)
- projektívy (projekcia a mikrofotografie)
- širokouhlé
- okuláry s dioptrickou korekciou
46
kondenzor
- sústreďuje paprsky pre dokonalé osvetlenie zorného poľa
- mikroskop najlepšie rozlišuje ak sa NA objektívu a konsenzoru zhodujú
- typy: Abbeho, aplanatický, aplanaticko-achromatický
47
zisk a odber cytogenetického materiálu
- na metafázne analýzy: intenzívne próoferujúce bunky (krvné, epiteliálne, sliznice, plodová voda, nádorové bunky)
- médium pre kultiváciu
- rastliny: koreňové špičky, peľové materské bunky, kalus
- pre interfázne analýzy je možné použiť akékoľvek bunky
48
jednotlivé kroky prípravy cytogenetických preparátov
- predpôsobenie (fytohemaglutinín, potom kolchicín)
- hypotónia (0,075 M KCl)
- fixácia (zvyšuje kontrast, metanol + kys. octová 3:1)
- u rastlín macerácia (= roztlaky)
- kvapkanie (alebo roztlaky)
- farbenie (Feulgenovo farbenie)
- uzatváranie preparátov (nie u ľudských)
49
synchronizácia bunkových kultúr
- získanie väčšieho počtu mitóz
- amethopterín, 5-fluorodeoxyuridín
- blokáda syntézy DNA
50
zhotovenie parafínových rezov
- odber
- fixácia (formaldehyd)
- dehydratácia etanolovou radou
- prevedenie do xylénu
- prevedenie do xylén-parafínu
- prevedenie do parafínu
- rezanie na mikrotomu
- prevedenie rezov na sklíčko
- deparafinácia (zahriatím)
- farbenie
51
príprava parafínových rezov pre I-FISH
- deparafinácia
- denaturácia skiel
- hybridizácia s DNA sondou
- odmytie nenaviazanej sondy
- pozorovanie a hodnotenie signálu
- vyšetrenie aberácií
52
materiál pre vyšetrenie karyotypu
- periférne lymfocyty (T-lymfocyty)
- fibroblasty
- stery bukálnej sliznice
- amniocyty
- choriové klky
- kostná dreň
- nádorové tkanivo
- periférna krv sa odoberá do skúmavky s heparínom
53
neoptimálne prostredie pri vyhotovavaní cytogenetických preparátov
- vysoká vlhkosť: kys. octová sa dlho vyparuje a dochádza k degradácii bunkových membrán, chromozómy sú rozsypané
- nízka vlhkosť: kys. ocotová sa vyparuje rýchlo a chromozómy sú nedostatočne rozložené
-optimálne podmienky: 20 stupňov a 40 - 45 % vlhkosť
54
využitie PC analýzy v cytogenetike
- vhľadávačka mitóz
- zostavenie karyotypu (software LUCIA)
- databáza
55
farbiace techniky chromozómov
- konvenčné farbenie (Giemsa, acetoorceín)
- prúžkovanie (Giemsa)
56
hybridizačné techniky v značení chromozómov
- molekulárna cytogenetika: aCGH, FISH, M-FISH
- použitie fluorescenčných sond
57
triedy chromozómov
- A: veľké metacentrické chromozómy (1, 2, 3)
- B: veľké submetacentrické chromozómy (4, 5)
- C: stredne veľké metacentrické alebo submetacentrické chromozómy (6 - 12, X)
- D: stredne veľké akrocentrické chromozómy so satelitmi (13, 14, 15)
- E: malé metacentrické alebo submetacentrické chromozómy (16, 17, 18)
- F: malé metacentrické chromozómy (19, 20)
- G: malé akrocentrické chromozómy so satelitmi (21, 22, Y - nemá satelit)
58
prúžkovacie metódy
- G-pruhy
- R-pruhy
- Q-pruhy
- C-pruhy
- T-pruhy
- NOR farbenie
- D-pruhy
59
farbenie heterochromatínu
- Q-pruhy
- C-pruhy
60
farbenie euchromatínu
- G-pruhy
- R-pruhy
- T-pruhy
- Q-pruhy
61
Q-pruhovanie
- AT oblasti vysoká fluorescencia
- GC oblasti nízka fluorescencia
- detekcia eu- aj heterochromatínu
- v praxi sa už nepoužíva
62
DAPI pruhovanie
- pseudo G-pruhy
- používa sa u aCGH, SKY, FISH
63
G-pruhovanie
- interakcia s DNA po denaturácii proteínov (inkubácia v soľných roztokoch alebo pôsobením trypsínu)
- trvalé preparáty
- horšie farbenie distálnych častí
- počet pruhov závisí na stupni kondenzácie chromozómov
- tmavé pruhy = AT
- svetlé pruhy = GC
- zmes metylénovej modrej a eozínu
- vysoké rozlíšenie - natiahnutie chromozómov - použitie EtBr (detekcia mikrodelécií, už sa nepoužíva, nahradené technikou FISH)
64
R-pruhovanie
- reverzné ku G-pruhovaniu
- používa sa k zobrazovaniu telomér
- ale vyvinuli sa vylepšené T-pruhy
65
C-pruhy
- konštitutívny heterochromatín
- výrazné C-pruhy na chromozómoch 1, 9, 16 a Y
- ako doplnkové vyšetrenie pre identifikáciu centromér
66
NOR-pruhovanie
- farbenie oblastí, ktoré v interfáze tvoria jadierko
- identifikácia akrocentrických chromozómov so satelitmi (13, 14, 15, 21, 22)
- ako doplnkové vyšetrenie pre overenie pôvodu markerových chromozómov
- detekcia oblasti NOR pomocou AgNO3
67
D-pruhovanie
- pôsobenie DNázou I, potom farbenie Giemsou
- AT páry sú citlivejšie
- zobrazenie inaktívneho chromozómu X
68
kvalita pruhovania
- KD menej pruhov (150 - 200 pruhov)
- lymfocyty periférnej krvi viac pruhov (300 - 400 - 550 - 850 pruhov)
- čím viac pruhov, tým vyššia kvalita
69
hetefomorfizmus chromozómov
- polymorfizmy v morfológii pruhovania
- rozlične dlhé úseky heterochromatínu
- distálne oblasti dlhých ramien Y
- centromerické oblasti 1, 9, 16
- krátke ramienka akrocentrických chromozómov
70
FISH princíp
1. denaturácia
- 90 - 100 °C, formamid, močovina, vysoké pH-
- dôležitá je teplota topenia DNA (Tm) - závisí na pH, zastúpení GC párov, iónovej sile, zložení roztoku
2. hybridizácia
- 30 - 45 °C (najčastejšie 37 °C)
3. odmytie nešpecificky naviazaných sond
- roztoky solí
71
FISH materiál
- metafázne chromozómy
- interfázne jadrá
- otisky nádorov
- parafínové rezy (deparafinácia)
- izolované DNA (= aCGH)
72
FISH typy DNA sond
- centromerické - identifikácia a počítanie chromozómov
- celochromozómové (maľovacie) - translokácie
- lokusovo špecifické - mikrodelécie
- celogenómové
- telomerické, ramenovo špecifické, pruhovo špecifické
73
FISH zdroje pre prípravu sond
- klonované sekvencie inkorporované do plazmidov, BAC, YAC
- somatické hybridné bunky
- chromozómy získané flow cytometriou
- mikrodisekcia chromozómov
- sekvencie amplifikované pomocou PCR
- syntetické oligonukleotidy
- v praxi sa často využíva kombinácia dvoch sond (napr. lokusovo špecifická a centromerická)
74
FISH značenie sondy
- rádioaktívne (trítium - rádioaktívny vodík)
- fluorescenčne (FITC)
- haptény (biotín + avidín)
- priame vs. nepriame
75
FISH značenie mechanizmy
- enzýmy (vytvorí sa zlom, DNázou I sa úsek vyštiepi, náhrada značenými nt)
- inkorporácia modifikovaných dUTP (počas PCR)
76
FISH využitie
- klinické (prenatálna a postnatálna diagnostika, nádory)
- evolučné štúdie karyotypu
- mapovanie ľudského genómu
- genetická toxikológia
- analýza vírových infekcií
77
FISH interpretácia výsledkov
- hodnotenie 5 mitóz
- 100 - 200 interfáznych jadier
- % vyjadrenie, koľko jadier má pozitívny signál
- inkorporovanie cut-off level
78
I-FISH
- dôležitý je počet a poloha signálu
- štúdium štruktúrnych chromozómových aberácií
- stanovuje sa pomer počtu signálov lokusu a centroméry (= kontroly), (napr. 1/2 je delécia; 5/2 amplifikácia) - - signálový index (menší ako 1 - delécia, väčší ako 1 amplifikácia)
-fúzny signál vzniká translokáciou
- štúdium početných aberácií pomocou centromerických sond, ale nemôžeme použiť na diagnostiku Downovho syndrómu pretože centromerická sonda k 21 kohybridizuje aj k 13
78
I-FISH detekcia translokácií
- splitové sondy (poznáme miesto translokácie) - normálne tvorí žltý signál, keď dôjde k translokácii signál sa rozštiepi na zelený a červený
- translokačné sondy (poznáme chromozómy a gény) - normálne zelený a červený signál, pri translokácii fúzuje do žltého
- teraz sa používajú sondy, kedy translokácia vytvorí 2 fúzne signály
78
fiber FISH
- mapovanie génov
78
SKY
- odlišný prístup ako M-FISH
- analyzuje spektrá, každému je počítačom priradená pseudofarba
- preto sa jednotlivé farby môžu prekrývať (využíva sa 5 farieb)
- je potrebná špeciálna SKY kamera a SKY farbičky
- kryptické translokácie, markery, pôvod translokácií, komplexné karyotypy
78
fluorescenčné farbenie chromozómov
- M-FISH
- SKY
- M-band
78
značenie M-FISH
- kombinatórne (5 fluorochrómov + DAPI, potrebujeme mikroskop so 6-úzkopásmovými filtrami)
- pomerové
78
M-BAND
- detekcia intrachromozómových prestavieb
- modifikácia M-FISH (použitie úzkopásmových filtrov)
- farebné pruhy sú ovplyvnené kondenzáciou chromozómov
- delécie, inverzie, inzencie
- ale veľmi drahá metóda, nedokáže nahradiť G-pruhy
79
metódy vyšetrenia chromozómových aberácií založených na izolácii DNA
- CGH a aCGH
- MLPA
- NGS
80
CGH
- metóda založená na FISH, ktorá počas jednej hybridizačnej reakcie dokáže identifikovať zisky a straty v rámci celého genómu
- nie je vhodná pre stanovenie ploidie a balancovaných zmien
- po denaturácii prebieha hybridizácia na metafázne sklá s mitózami
- kontrola (zelená) je genómová DNA zdravého jedinca
- sonda (červená) je genómová DNA pacienta
- kontrola aj sonda sú naštiepené a značené odlišnými fluorochrómami
- aCGH hybridizuje na čip
81
analýza výsledkov z CGH
analýza pomocou softwaru LUCIA CGH - vytvára grafický profil
- profil: zelená = delécia; červená = duplikácia; žltá = normál
- číselné hranice profilu CGH: 0,8 a menej (delécia, monozómia); 1,2 a viac (duplikácia, trizómia)
82
kedy sa používala CGH
- nemožnosť klasického vyšetrenia karyotypu
- charakterizácia nebalancovaných CHA (delécie, duplikácie, markerové chromozómy)
- identifikácia komplexných prestavieb
- identifikácia kryptických prestavieb u pacientov s normálnym karyotypom
- onkocytogenetické analýzy (celogenómový profil)
- nebalancované zmeny v rozsahu 5 - 10 Mb
82
zápis karyotypu z CGH
- rev ish enh (1p11.1-p31, 1q, 2p23-pter, 12q22-qter, 17p11.1-p12, 17q) = zisk
- rev ish dim (8p21-pter, 16q, X) = strata
82
aCGH
- sonda aj kontrola hybridizujú na čip (BAC, oligonukleotidy)
- vyššie rozlíšenie
- nemusí sa karyotipovať
- snímanie scanerom
- analýza pomocou softwaru
- automatizácia
83
typy DNA mikročipov
- podľa značenia a počtu snímaných farieb: jednokanálové a dvojkanálové
- podľa druhu sondy: BAC (150 - 200 kb), oligonukleotidové (napoužívanejšie, 60 kb)
- podľa aplikácie: aCGH (CHA), SNP array (genotypovanie, detekcia mutácií a polymorfizmov), hybridné (
84
na čom závisí rozlíšenie aCGH
- typ a veľkosť klonov
- počte a vzdialenosti sond
- na konštrukcii DNA čipu
85
analýza výsledkov aCGH
- vyjadruje sa ako logaritmus
- log2 (1/2) = -1 (delécia)
- log2 (2/2) = 0 (normál)
- log2 (3/2) = 0,56 (zisk)
86
zápis karyotypu aCGH
- arr(1-22,X)x2 - normálna žena
- arr(1-22)x2,(XY)x1 - normálny muž
- arr(21)x3 - Downův syndrom
- arr(X)x2,(Y)x1 - Klineferterov syndróm
- arr Xq25(126,228,413-126,535,347)x1 - delácia na Xq
87
príklady vyšetrenia pomocou aCGH
- preimplantačné vyšetrenie
- prenatálna diagnostika
- postnatálne vyšetrenie
- onkocytogenetika
88
prenatálna cytogenetická diagnostika
- vyšetrenie karyotypu plodu u tehotných žien s rizikom
- prevencia narodenia detí s poruchami duševného a telesného vývoja
- cieľom je vylúčiť alebo diagnostikovať závažné genetické choroby
- poskytuje genetické poradenstvo
- odber plodovej vody, klkov choria, pupočníkovej krvi (alebo voľná fetálna DNA)
89
umelé prerušenie tehotenstva z genetických príčin je možné vykonať do koľkého týždňa?
24
90
PGD indikácie k vyšetreniu karyotypu
- vek otca a matky (18 - 35)
- anomálie zistené na UZ alebo biochemicky
- nosičstvo balansovanej translokácie alebo inej aberácie
- predchádzajúce narodenie dieťaťa s aberáciou
- styk s mutagénmi alebo teratogénmi
91
štatistiky PGD - najčastejšie diagnózy
- Downov syndróm
- Edwardsov syndróm
- Patauov syndróm
- iné CHA
- gonozómové aberácie
92
screening v tehotenstve
- vyšetrenie predom definovanej skupiny ľudí s cieľom vyhľadávania chorôb v ich časných štádiách, keď pacient ešte nemá príznaky
93
metódy PGD
1. invazívne
- amniocentéza
- kodrocentéza
- odber choriových klkov
- fetoskopia
2. neinvazívne
- vyšetrenie počas 1. a 2. trimestra
- odporučené každej tehotnej žene
- nevyžadujú zásah do amnionu a neohrozujú plod
- UZ vyšetrenie
- biochemické markery: AFP, hCG, E3, PAPP-A
94
UZ vyšetrenie plodu
- počet, vitalita, nepriame znaky súvisiace s VVV (prejasnenie záhlavia plodu, rastová retardácia, zmeny postavenia palca na ruke)
- nález je dôvodom k vyšetreniu karyotypu
- 12. týždeň, 20. týždeň, 30. týždeň
95
biochemický screening u PGD
- alfa-fetoproteín: zníženie u trizómií
- ľudský choriový gonádotropín: zvýšenie u DS
- nekonjugovaný estriol: zníženie u DS a ES
- pregnancy-associated plasma protein: zníženie u DS
96
kedy sa robia screeningové vyšetrenia v tehotenstve
- v prvom trimestri: vek, šijové prejasnenie, srdcová frekvencia, hCG, PAPP-A (odhalí 90% DS)
97
PGD diagnostické testy
- G-pruhy
- aCGH, I-FISH
- QF-PCR, NGS
98
Downov syndróm
- 47, XX/XY (+ 21)
- guľatá tvár
- malé ústa a veľký jazyk
- mongoloidné očné štrbiny
- široký koreň nosa
- kožná riasa na zátylku
- malá zavalitá postava
- opičie ryhy na dlani
- IQ 25 - 50
- srdcové vady
- náchylnosť k leukémiám
- dožívajú sa 50 rokov
99
príčiny vzniku Downovho syndrómu
- hlavnou príčinou je nondisjunkcia pri meióze I = prostá trizómia
- translokačná forma - Robertsonovská translokácia; der(14;21)
- parciálna trizómia - zmnoženie kritickej oblasti pre DS (21q21)
- mozaika
100
štruktúrne aberácie chromozómov
- stabilné vs. nestabilné
- balancované (inverzie, inzercie, translokácie) vs .nebancované (delécie, duplikácie, ring, izochromozóm)
- subchromatídové vs. chromatídové vs. chromozómové
- intrachromozómové vs. interchromozómové
- otvorené (delécie) vs. výmenné (translokácie)
101
početné aberácie chromozómov
- aneuploídie (monozómie, trizómie)
- polyploídie (monoploídie, triploídie)
102
klasifikácia VCA
- podľa objaviteľa
- podľa príznakov
- podľa lokalizácie
103
vznik štruktúrnych CHA
1. spontánne - poškodenie DNA, poruchy reparácie
2. indukciou - klastogénmi
1. vrodené
2. získané
- rozhodujúcim momentom je vznik DSB
104
molekulárne mechanizmy vzniku štruktúrnych CHA
- poškodenie DNA a absencia opravy (vznik terminálnych delécií a fúznych chromozómov, duplikácie)
- poškodenie DNA a poruchy pri reparácii
- poruchy pri replikácii
- poruchy pri rekombinácii
105
mikrodelečné syndrómy
- 2 - 4 Mb
- nie sú detekovateľné klasickými cytogenetickými metódami
- špecifické príznaky
- podmnožina CNV = patogénne CNV
- rekurentné (rovnaký rozsah delécie u nepríbuzných pacientov) vs. nerekurentné
106
genetické dôsledky mikrodelécií
- haploinsuficiencia
- LOH
- syndrómy naväzujúcich génov
- neúplná penetrancia a variabilná expresivita
107
syndróm cri du chat
- del 5p
- rôzny rozsah delécie (malý úsek až celé ramienko)
- typický krik novorodenca
- guľatá hlava, mikrocefália
- srdcové vady
- PMR
- faciálna dysmorfia (pretiahnutá tvár, široký nos)
- patrí medzi syndrómy s terminálnou deléciou
108
DiGeorgov syndróm
- del 22q11
- AD s variabilnou expresivitou
- C (cardiac): srdcové vady
- A (abnormal facies): faciálna dysmorfia
- T (thymus): hypoplázia týmusu
- C (cleft palate): rozštepy
- H (hypocalcemia): nedostatok vápnika, kŕče
- imunodefekty
- prenášané hlavne materským chromozómom
- vo väčšine prípadov sa ale jedná o vznik de novo
- vyšetrenie začína karyotypom, potom I-FISH, MLPA a aCGH
- pri aCGH zistíme presnú veľkosť delécie
109
Prader-Willi a Angelmanov syndróm
- del 15q11-13
- vplyv genomového imprintingu
110
Prader-Willi genetické príčiny
- delécia na paternálnom chromozóme
- maternálna UPD
- zmeny imprintingu
- rôzne prestavby
111
Angelman genetické príčiny
- delécia na maternálnom chromozóme
- paterálna UPD
- zmeny imprintingu
- rôzne chromozómové prestavby
- delécia v géne UBE 3A
112
Prader-Willi klinická manifestácia
- znížená aktivita plodu
- neprospievanie kojencov
- hypotónia plodu
- hyperfágia (problémy v hypotalame)
- obezita
- hypogenitalizmus/gonadizmus
- PMR (IQ 60 - 80)
- malá postava
- problémy so správaním
113
114
metódy pre stanovenie diagnózy P-W a Angelmana
- karyotyp
- I-FISH, aCGH, MLPA
- PCR, metylačná analýza
114
vznik duplikácií
- NAHR
- sekundárne pri segregácii
- pri replikácii
- brekage-fusion-bridge
114
Angelman klinická manifestácia
- happy puppet syndrome
- vážna PMR
- trhavé pohyby, zlá rovnováha
- škúlenie
- výkriky, šťastná povaha
- epilepsia
- hypotónia
- hypopigmentácia
114
Williams-Beurenov syndróm
- del 7q11
- AD
- detekcia FISH, MLPA, aCGH
- škriatkovitá tvár
- malá postava
- mikrocefália
- stredná PMR
- vadný skus
- stenózy, hyperkalcémia
- priateľská povaha, hyperaktivita, hrubý hlas
115
druhy duplikácií
- tandemová
- reverzná
- intrachromozomálna
- interchrmozomálna
- mutácia génu Bar u drozofily
116
Charcot-Marie Tooth synróm
- dup 17p
- AD
- efekt dávky génu (myelínový proteín)
- neurologické ochorenie
- kladívkovité prsty
- atrofia svalov
- bolesti a kŕče dolných končatín
- poruchy rovnováhy
- väčšina vzniká poruchou pri mužskej meióze
117
markerové chromozómy
- inv dup 15 (inverzia a duplikácia v centromérovej oblasti)
- malé nadpočetné chromozómy, ktoré nie je možné analyzovať cytogenetickými pruhovacími metódami
- neobsahujú centromérové sekvencie a aj napriek tomu sú stabilné (neocentroméry), nesú funkčné kinetochory a stabilne sa delia
- často bez telomér (ring)
118
klasifikácia markerových chromozómov
- satelitné (najčastejšie 15, 13, 14, 21, 22)
- nesatelitné (1, 9, 16)
- odvodené od gonozómov (X)
119
význam a identifikácia markerových chromozómov
- bez euchromatínu (nemusia mať vplyv na fenotyp)
- s euchromatínom (parciálne trizómie)
- identifikácia: FISH, SKY pruhovanie,
120
markerové chromozómy a korelácia genotyp-fenotyp
závisí to na
- množstve euchromatínu
- uniparentálnej dizómii
- mozaicizmom markerových chromozómov
121
delenie neplodnosti
- primárna (počas jedného roku nedošlo k otehotneniu)
- sekundárna (nedošlo k otehotneniu aj keď už má žena dieťa)
122
príčiny neplodnosti delenie
- gynekologické alebo andrologické
- hormonálne
- imunologické
- hematologické
- genetické
123
najčastejšie príčiny neplodnosti u žien
- poškodenie vajcovodov
- hormonálne poruchy
- VVV delohy a vaječníkov
- endometrióza
- fajčenie
- genetické faktory = 7 %
124
najčastejšie príčiny neplodnosti u mužov
- nízka kvalita spermatu
- urogenitálne infekcie (chlamýdie)
- varikokéla
- poškodenie semenovodov
- životný štýl (obezita, alkohol, fajčenie, stres, drogy)
- genetické faktory = 15 %
125
genetické príčiny neplodnosti
- CHA (VCA a ZCA)
- génové mutácie (mikrogelécie v oblasti ASF na Y, Leidenská mutácia, mutácia CFTR)
- multifaktoriálne dedičné ochorenia
126
genetické nálezy asociované s poruchami mužskej reprodukcie
- Klineferterov syndróm
- syndróm Jacobsonovej
- muži s karyotypom 46, XX a 45, X
- štruktúrne aberácie Y: delécie, ring, izochromozóm, inverzie, translokáce
- tiež translokácie na autozómoch
127
dôsledky inverzií
- po rekombinácii je zvýšené riziko tvorby abnormálnych gamét
- paracentrická inverzia - význam v evolúcii druhov
- pericentrická
128
genetické nálezy asociované s poruchami ženskej reprodukcie
- Turnerov syndróm
- 46, XX (del Xp)
- Robertsonovské translokácie
- reciproké translokácie
129
translokácie (rozdelenie a detekcia)
- balansované vs. nebalansované
- Robertsonovské
- komplexné
- detekcia: G-pruhy, FISH, M-FSH, aCGH, I-FISH (fúzne signály)
- balansované translokácie sú významnou príčinou sterility u prenášačov, vznikajú v dôsledku aberantnej segregácie
130
dôsledky reciprokých translokácií
- neplodnosť
- dieťa môže zdediť úplne normálne chromozómy, rovnakú traslokáciu alebo nebalansovanú translokáciu
- samovoľné potraty
131
Robertsonovské translokácie
- akrocentrické chromozómy
- najčastejšia = t (13;14)
- t (14;21) - dedičná forma DS (pravdepodobnosť manifestácie je 100 %)
132
cytogenetické metódy v genetickej toxikológii
- metafázne analýzy: klasické farbenie chromozómov, SCE, FISH
- interfázne analýzy: mikrojadrový test
133
klasické metódy v genetickej toxikológii
- testovanie mutagenicity
- biologické monitorovanie
134
aký typ CHA vyvoláva ionizujúce žiarenie
- chromatídové
- najmä dicentrické chromozómy
135
aký typ CHA vyvolávajú chemické mutagény
- chromatídové
- vznik najmä pri replikácii
136
CAPL
- najmä na účely biologického monitorovania
- individuálny test
- skupinový expozičný test
- ZCA sú časným dôsledkom (deterministickým)
- nádory sú neskorým (stochastickým)
- práca v rizikovom prostredí
- chemoterapia
- zisťujeme konvenčným farbením, pretože pruhy by zakryli zlomy
- udáva sa celkový počet aberantných chromozómov v %
- typy aberácii: zlomy, acentrické fragmenty, di- a tricentrické chromozómy, translokácie
- hodnotenie: skupina viac ako 200 osôb = 100 mitóz, jednotlivci a menšie skupiny = 200 mitóz
- skupina do 2 % je normál, viac ako 4 % značí vysokú expozíciu
- jednotlivec do 5 % norma
137
faktory ovplyvňujúce spontánnu variabilitu v CHA
- metabolické polymorfizmy
- reparačné procesy
- imunita
- nededičné: životný štýl, ochorenia, kvalita prostredia
138
využitie FISH v genetickej toxikológii
- detekcia stabilných aberácii
- tiež reciprokých translokácií
- celochromózomé sondy (napr. požitie sond voči dvom chromozómom)
139
využitie SCE v genetickej toxikológii
- inkorporácia BrdU počas S fázy
- farbenie chromozómov pomocou Giemsy (rozdielna farba s a bez BrdU)
- harlekínske chromozómy
- indikátor poškodenia pri replikácii
- v praxi sa veľmi nevyužíva
- mutágeny zvyšujú frekvenciu chromatídových výmen
140
mikrojadrový test
- blokovanie cytokinézy cytochalazínom
- hodnotí sa mikrojadro
- čím viac mikrojadier, tým viac je bunka poškodená
- pôvod MJ: acentrické chromozómy, celé chromozómy
- pomocou FISH vieme určiť pôvod mikrojadier
141
objavitelia Ph chromozómu
- Nowell
- Hungerford
142
terapia u pacientov s Ph chromozómom
- glivec, imatinib, dasatinib
- inhibítory tyrozín kinázy BCR-ABL
- zabraňujú fosforylácii tým, že sa viažu do väzbového miesta pre ATP
143
úloha cytogenetického vyšetrenia v onkológii
- upresnenie diagnózy a stanovenie prognózy
- stratifikácia pacientov, stanovenie liečebnej stratégie
- diferenciálna diagnostika
- monitorovanie liečby (predikcia citlivosti k liečbe)
- sledovanie reziduálnej choroby po resekcii
- predpoveď pravdepodobného vývinu ochorenia
- lokalizácia protoonkogénov a tumor supresorových génov
144
onkocytogenetické metódy
- klasické vyšetrenie (G-pruhy)
- FISH (najmä I-FISH)
- M-FISH, SKY, M-BAND
- aCGH
145
G-pruhovanie v onkocytogenetike
- najmä hematologické malignity
- použité sú bunky kultivované in vitro, najmä bunky KD
- nepoužíva sa PHA
- úspešnosť okolo 80 %
- horšia morfológia chromozómov, málo mitóz
- hodnotí sa najmenej 20 mitóz
- býva menej pruhov
146
klonálne CHA u nádorov
- bunkové populácie sú zostavené z heterogénnych buniek
- väčšina zmien je klonálnych, ale existujú aj bunky s normálnym karyotypom
- karyotyp sa postupne vyvíja
147
nomenklatura v onkocytogenetike
- musí byť zapísaný aj klon
- uvádzajú sa len klonálne CHA v hranatých zátvorkách
- 47~50,XX,dup(3)(p12), del(5)(q31), +8,der(11)t(6;11), +16,+17,+mar ) [cp 20]
- u subklonov sa používa zápisu "idem" alebo sl (stem line) alebo sdl (side line) aby sa nepísalo to isté čo u hlavného klonu, za skratkou sa píše už len čo je naviac
148
definícia klonu v onkocytogenetike
- v 3 mitózach chýba rovnaký chromozóm
- v 2 mitózach je nadpočetný rovnaký chromozóm alebo je tu rovnaká štruktúrna aberácia
149
nádory sú typické mutáciami génov
- súvisiacich so starnutím (telomeráza)
- protoonkogénov (MYC, NEU, ABL, RAS, EGFR)
- tumor supresorových génov (p53, Rb1) - typická je LOH
150
základné rozdelenie CHA u nádorov
- primárne: stoja na počiatku vzniku nádoru
- sekundárne: objavujú sa počas karcinogenézy a poskytujú náhľad do štádia ochorenia, môžu byť prognostickým faktorom
- špecifické: marker určitého typu nádoru (tiež vplyv na prognózu)
- náhodné
151
prediktívna vs. prognostická hodnota
- prediktívna = vplyv na liečbu
- prognostická = vplyv na prognózu
152
aké typy CHA sa u nádorov vyskytujú
- delécie
- dupkilácie
- inverzie
- inzercie
- translokácie
- monozómie
- trizómie
- polypoidie
- amplifikácie
153
početné CHA u nádorov a ich dôsledky
- hyperdiploídia = viac ako 46 chromozómov (CLL a mnohopočetný myelóm) - lepšia prognóza
- hypodiploídia = menej ako 46 chromozómov - horšia prognóza
- metódy vyšetrenia: klasická cytogenetika, I-FISH, flow cytometria, aCGH (nie polyploídie)
154
vyšetrenie leukémií pomocou flow cytometrie
- počíta sa DNA index = relatívny obsah DNA v bunkách počas G0/G1 fázy
- index 1,16 zodpovedá hyperdiploidii a u ALL to vypovedá o dobrej prognóze
- umožňuje stratifikáciu liečby podľa miery rizika
155
dôsledky translokácie u nádorov
- tvorba fúzneho génu zapojeného v malígnom procese
- premiestnenie génu do oblasti silného promótoru, často TF
156
podstata Ph chromozómu
- t (9; 22)
- CML
- onkogén ABL z chromozómu 9 je premiestnený na chromozóm 22 do oblasti B-cell receptor, ktorý je intenzívne exprimovaný
- vzniká fúzny gén BCR/ABL, ktoré produktom je hybridný proteín p210
157
podstata fúzneho proteínu PML/RARA
- t (15; 17)
- AML
- terapia kyselinou all-trans retinovou (ATRA)
158
translokácie zahrnujúce c-MYC
t (8; 14)
- u ALL a lymfómov
- c-myc je presunutý do oblasti kódujúcej ťažký reťazec imunoglobulínu
t (2; 8), t (8; 22)
- presunutie do oblasti kódujúcej ľahký reťazec kappa
159
dôsledky delécie u nádorov
- často postihuje nádorové supresory
- del 5q (AML, MDS) - gény riadiace normálnu hematopoézu
- del 11q23 (AML, ALL) - gén MLL
- monozómie (MDS) - 5 a 7
- del 13q14 (retinoblastóm) - gén Rb1
- del 11p13 (Wilmsov tumor) - gén WT1
- del 1p36 (neuroblastóm)
- del 17p13 - p53
160
dôsledky duplikácií, trizómií u nádorov
- časté sekundárne zmeny
- progresia ochorenia
- leukémie + 8, CLL + 12
161
dôsledky amplifikácii u nádorov
- časté u solídnych nádorov
- zmnoženie protoonkogéno myc, HER2
- double minutes, homogénne sa farbiace oblasti
- vyšetrenie pomocou aCGH a I-FISH
- diagnostický a prognostický význam
162
komplexný karyotyp u nádorov
- štruktúrne a početné aberácie zahrnujúce tri a viac chromozómov
- dochádza k trom a viac zlomom
163
chromotripsis
- nový mechanizmus vzniku nádorov
- desiatky až stovky prestavieb na jednom chromozóme, ktoré vznikli pri jednej katastrofickej udalosti
- chromozóm je rozbitý na malé kúsky, a potom je pomocou reparačných mechanizmov poskladaný späť
- bežne u 2- 3 % nádorov
- ale u nádorov kostí až 25 %
- horšia prognóza
164
CML
- u 95 % prítomný Ph chromozóm
- v géne BCR existujú tri zlomové oblasti
- najlepšiu prognózu majú pacienti, ktorý majú v čase diagnózy Ph ako jedinú zmenu
- BCR/ABL detekcia pomocou I-FISH
- zápis: nuc ish(ABL1x2),(BCRx2),(ABL1 con BCRx1)[400]
- con = fúzny signál, v hranatej zátvorke je počet pozitívnych buniek buniek (môže sa uviesť aj pomer)
165
AML
- klonálne CHA
- chromozómové zmeny, ktoré sú prítomné v dobre diagnózy počas liečby vymiznú, ale opäť sa objavia počas remisie, často s ďalšími sekundárnymi zmenami
- t (8; 21) - ETO, AML1 (dobrá prognóza)
- t (15; 17) - PML/RARA (dobrá prognóza)
- inv (16), t (16; 16) - CBF/MYH11 (dobrá prognóza)
- FISH s lokus špecifickou sondou
- disrupcia génu MLL (11q23) - nepriaznivá prognóza - disrupčná DNA sonda
166
MDS
- del 5q
- časté komplexné zmeny (krátka doba prežitia
- FISH
167
ALL
- deti
- typické sú početné abnormality
- hyperdiploídia - dobrá prognóza
- hypodiploídia - zlá prognóza
168
CLL
- trizómia 12 - lepšia odpoveď na chemoterapiu
- del 13 (Rb) - horšia prognóza
- del 17p (p53)
169
mnohopočetný myelóm
- staršie osoby
- nevyliečiteľné ochorenie
- malígna mutácia vo vývoji B-lmyfocytov
- hypo a hyperdiploídia
- translokácie zahnujúce IgH gén - zlá prognóza
- delécia Rb
- delécia p53
- zisk 1q21 - zlá prognóza
170
FICTION
- používaná u pacientov s mnohopočetných myelómom
-
171
materiály a metódy pre cytogenetiku solídnych nádorov
- výpotek
- uzlina
- kultivácia nádorových buniek
- odtlačky nádorov
- parafínové rezy
- metódy: najmä I-FISH (lokusovo špecifické sondy)
172
problémy v cytogenetike solídnych nádorov
- náročnosť dlhodobej kultivácie
- nedostatok mitóz, kvalita preparátov
- komplexita karyotypu
- heterogenita nádorov
173
personalizovaná medicína u nádoru prsníka
- stanovenie amplifikácie EGFR
- EGFR je významným prognostickým a terapeutickým markerom
- 25 - 30 %
- amplifikácia je spojená s o zlou prognózou (rýchla proliferácia)
- terapia herceptínom (inhibítor HER2)
- amplifikácia vo forme: polyzómie, pravej amplifikácie a double minutes
174
cytogenetické zmeny u niektorých solídnych nádorov detí
- del 13q14 (RB1) - retinoblastóm
- del 11p13-15; del 16q (WT1) - Wilmsov tumor
- t (11;22)(q24q12) - EWS-FLI1 - Ewingov sarkóm
- neuroblastóm: amplifikácia n-myc, del 1p36, del 11q, gain 17q
- meduloblastóm: amplifikácia c-myc (zlá prognóza)
175
personalizovaná medicína u nemalobunkového nádoru pľúc
- mutácie KRAS, EGFR, ALK
- pacienti s mutáciou ALK a fúznym génom EML-ALK sú liečení inhibítorom kinázy ALK = critozinib
- mutácia EGFR: gefitinib, erlotinib
176
ako delíme euploídie
- monoploídie vs. polyploídie
- autopolyploídie (rovnaké genómy) vs. alopolyploídie (rôzne genómy)
- orthopolyploídie (párne) vs. anorthopolyploídie (nepárne)
177
ako delíme aneuploídie
- nulizómia
- monozómia
- trizómia
- tetrazómia
- ...
178
význam polyploídie
- častá u rastlín (50 % kvitnúcich rastlín, 70 % tráv)
- spojená s vznikom nových druhov, väčšie rastliny, väčší objem plodu a rastliny bez kôstok
- málo častá u živočíchov
- ale existujú polyploidné jesetery, obojživelníky, lososy
- bunky v niektorých tkanivách sú polyploidné
179
príklady polyploídnych rastlín
- zemiak (4n) - 48; auto
- banán (3n) - 33; auto
- arašíd (4n) - 40; auto
- bavlník (4n) - 52; alo
- pšenica (6n) - 41; alo
- jahoda (8n) - 56; alo
180
vznik polyploidov
- spontánne
- cielene pôsobením kolchicínu na deliace vretienko
- cielenou hybridizáciou
- fyzikálne faktory (tepelné šoky, žiarenie)
- znížená plodnosť u anorthopolyploidov
181
význam monoploídie u rastlín
- ľahká identifikácia mutácií
- po pôsobení kolchicínu, ľahké získanie homozygotov
182
monoploídia u blanokrídlych
- včely, osy, mravce
- 2n = 32; n = 16
- gaméty sú produkované mitózou
- samice = AA; samce = A
- u iných živočíchov letálne
183
vznik autotriploida
- spontánne poruchou meiózy (kombinácia diploidnej a haploidnej gaméty)
- hybridizáciou autotetraploida a autodiploida
- časté poruchy v meióze - sterilita
- ovocie bez semien
184
vznik autotetraploida
- porucha meiózy, mitózy (nondisjunkcia celej sady)
- pôsobením kolchicínu na diploida
- polyploídia udržiava heterozygotnosť lepšie ako diploídia
185
alopolyploídia
- medzidruhová hybridizácia
- jedince vznikajú na základe zmnoženia genómov rôznych druhov
- vznikajú jedince heterogenómové = amfidiploidné
- zdvojenie chromozómov sterilného hybrida (AB --> AABB)
- moderná pšenica je alohexaplidom (vznikla z troch rôznych genómov)
186
tkanivovo špecifická polyploídia a polyténia
- pečeňové bunky stavovcov
- megakaryocyty v KD
- stonka a parenchým v apikálnej časti rastlín
- polyténne chromozómy u diptera
187
polyploídia u človeka
- spontánne potraty
- nádory
