Genética- Protocolos Perguntas Flashcards
Quais os reagentes necessários para PCR?
o H2O
o Tampão de PCR
o MgCl2
o Primer direto
o Primer reverso
o dNTPs
o Taq polimerases
Porque é importante lavar com etanol a 30% e não a 100%?
o Os 30% de água deste etanol são importantes para lavar o excesso de sais.
o Com o de 100% etanol não conseguimos fazer tão bem.
A concentração de DNA pode ser determinada através de que técnicas?
o Medição da absorvância por espetrofotometria
o Eletroforese em gel de agarose
Porque adicionamos Glicerol à amostra na eletroforese?
- Para dar peso à amostra.
Como é que a quantidade de agarose afeta a malha da eletroforese?
- Quanto maior a quantidade de agarose utilizada, menores vão ser os buracos da malha que forma.
O que veríamos na eletroforese se o DNAgenómico tivesse sido degradado?
- Se o DNA genómico estiver degradado (em pequenos fragmentos) iriamos ver uma banda constante.
O que são células competentes?
- São células bacterianas alteradas em laboratório, que têm uma parede celular que permite a passagem de DNA exterior para o interior.
- Um método usado para tornar as células competentes é o método químico que usa cloreto de cálcio quando se encontram na fase exponencial.
O que é que os plasmídeos vetores contém?
- Polylinker formado por sequências reconhecidas por diferentes enzimas de restrição.
- Gene de resistência a um antibiótico(por exemplo, a ampicilina).
O que vai determinar se a célula bacteriana vai ser resistente à ampicilina?
- Se permitiu a entrada do vetor ou não. Se não tiver permitido, não tem resistência e morrerá.
Qual a sequência genética responsável pela produção de β–galactosidase?
- sequência lacZ!
No final da realização da clonagem do DNA que células vamos obter? Nota: existem 3 hipóteses.
- Células competentes resistentes à ampicilina mas não produzem β–galactosidase. (DNA dador interferir no gene lacZ);
- Células competentes resistentes à ampicilina produtoras de β–galactosidase (não houve DNAdador);
- Células competentes que morrem (não terem sido transformadas).
Completa a seguinte frase:
As células transformadas produtoras de β–galactosidase vão tornar-se …..
- Azuis! Pois não houve ligação entre o vetor e o DNAdador o que fez com que houvesse conversão do seu substrato X-Gal num precipitado de cor azul.
Quais são as células que nos interessam para o experimento e de que cor elas ficarão?
- Células competentes resistentes à ampicilina mas não produzem β–galactosidase.
- Ficarão de cor Branca!
O que são cadeias palindrómicas ou palindromas?
- Uma sequência de DNA é um palíndroma quando a sua leitura na direção 5’ para 3’ é idêntica à sua leitura na direção 3’ para 5’, quando esta última é invertida. Em outras palavras, é uma sequência que é idêntica quando lida de trás para frente.
As enzimas de restrição produzem …..
- Cadeias palindrómicas.
Qual a diferença entre Neosquizómeros e Isosquizómeros?
- Neosquizómeros – diferentes enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência, mas cortam-na de diferentes maneiras.
- Isosquizómeros – enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência e cortam do mesmo modo.
As endonucleases de restrição estão divididas em que tipos? Distingue-os!
- Estão divididas em 3 tipos: Tipo I; II; III.
- Tipo I⭢ o local de reconhecimento e restrição diferem e estão longe.
- Tipo II ⭢ o local de reconhecimento e restrição são os mesmos.
- Tipo III ⭢ reconhecem 2 sequências não palindrómicas separadas e inversamente orientadas.
Complete a seguinte frase:
A neutralização da carga das bactérias é feita com ………
- cloreto de cálcio.
Qual o objetivo do choque térmico depois da adição dos vetores?
- O choque térmico serve para o DNA entrar nas bactérias;
- SOC serve para as bactérias recuperarem do choque térmico.
Em que consiste o Método de Sanger?
- Adiciona-se inibidores da replicação do DNA: ddNTPs (didesoxiribonucleótidos trifosfatados).
- Estes ddNTPs não possuem o grupo 3’-OH pelo que não conseguem ligar-se a outros nucleótidos, impedindo assim o processo de replicação.
Quais as vantagens do Método de Sanger?
- Simples;
- Flexível no que diz respeito ao local da marcação (primer, dNTP ou ddNTP) e o tipo de marcador utilizado (radioativo ou ligado a um flurocromo).
Em que consiste o Método de Maxam-Gilbert?
Quais as desvantagens do Método de Maxam-Gilbert?
- Demorado;
- Dispendioso;
- Utilizava reagentes tóxicos;
- DNA a ser sequencializado tinha de ser obrigatoriamente purificado.
A que concentração está uma amostra pura de DNA com valor de A260 de 1?
- 50 μg/ml!
Qual o propósito de um sistema tamponado na eletroforese?
- O sistema tampão de eletroforese (TAE) é essencial para a passagem da corrente elétrica: dá eletrólitos à solução e ajuda a manter o pH da solução.
A DNApolimerase lê a cadeia molde em que direção?
- Lê de 3’-5’!
- Sintetiza de 5’-3’!
Qual a diferença entre a Pfu e a Taq?
- Ambas provêm de organismos diferentes.
- Pfu ⭢ maior fidelidade por possuir uma atividade exonucleolítica 3’ -> 5’, oq confere um emparelhamento correto das bases complementares.
-
Taq ⭢ menos suscetível a degradação da
sequência amplificada.
O que são células competentes?
- Células modificadas artificialmente para que o DNA exterior consiga entrar dentro das mesmas. Isto acontece devido a alterações na parede celular.
Como funciona o cloreto de cálcio para tornar as células quimicamente competentes?
- O cloreto de cálcio vai neutralizar a carga da membrana das bactérias, oq contribui para a
entrada de DNA dentro das células bacterianas.
Indique duas características comuns a todos os tipos de vetores de clonagem.
- Conseguem incorporar DNA estranho e levá-lo para dentro de uma bactéria, onde vai ser reproduzido de forma autónoma, dentro das células, contêm um marcador genético que permite a seleção (normalmente resistência ao antibiótico), contêm locais de restrição que facilitam a clonagem do fragmento a inserir e contêm uma quantidade mínima de DNA não essencial, oq otimiza a clonagem.
Qual a aplicação prática do “polylinker” dum plasmídeo vetor?
- Contém múltiplos sítios de restrição para enzimas de restrição. Cada sítio de restrição é uma sequência específica de nucleotídeos reconhecida por uma enzima de restrição particular.
“É possível obter uma ligação dum fragmento de DNA a um vetor de clonagem usando somente extremidades coesivas (sticky-ends).” A afirmação é verdadeira ou falsa? Justifique.
- Não, para estas extremidades se formarem é necessário haver a formação de ligações covalentes. Estas são feitas por DNA ligases.
O que entende por “ligação T-A” e em que condições pode fazer uma reação deste tipo?
- É uma ligação direta do DNA dador ao vetor, através da extremidade 5’ do DNA. Esta é rica em A, havendo assim ligação aos T’s do vetor, que se encontram também na extremidade. Isto pode ocorrer após o PCR.
