Exercice 5-isolation of chromosomal DNA Flashcards
Comment le pourcentage d’agarose affecte la migration des molécules d’ADN
plus de % d’agarose=séparation de molécules d’ADN plus petites
Que se passe lorsqu’on chauffe l’échelle lambda vs non chauffé
chauffé= structure linéaire car on détruit les sites COS
Non-chauffé=structure circulaire car il y complémentarité de sites COS
comment initier la lyse cellulaire de la bactérie pour l’isolation d’ADN
resuspendre le culot de cellules bactériennes (après centrifugation) dans un tampon contenant des lysozymes et EDTA
Rôle de l’EDTA et lysozyme pour la lyse des bactéries
le lysozyme va dégrader les petidoglycans tandis que l’EDTA va déranger la membrane des bactéries gram négatives en enlevant le Mg2+ de la couche liposacchridique
deuxième étape de la lyse cellulaire (après EDTA et lysozyme)
l’ajout du détérgeant comme le SDS
Rôles du SDS pendant la lyse cellulaire
solubilise les membranes cellulaires et dénature les protéines, aidant ainsi à libérer l’ADN plasmidique dans la solution
pourquoi effectuer la séparation au phénol-chloroforme après le SDS
car le phénol et le chloroforme vont séparer les protéines, lipides, polysaccharides et les acides nucléiques
quelles phases on peut obtenir après une extraction phénol-chloroforme
phase aqueuse=acides nucléiques
interphase blanche=protéines précipitées
phase organique=lipides et polysaccharides
pourquoi utiliser la protéinase K
elle aide à enlever le restant des protéines ET elle n’est pas dénaturée par le SDS
étapes pour l’isolation de l’ADN après l’ajout de protéinase K
précipitation à l’éthanol suivie d’une traitement de RNAse pour enlever l’ARN
comment réduire l’activité de la DNAse (4 facons)
1) avoir un tampon avec un pH basique
2) ajouter EDTA pour chelater les ions Mg2+
3) ajouter du SDS pour dénaturer les DNAses
4) garder les réactifs froids
