Enzyme Cleaning and Isolation

Question 1

Τι είναι καθαρισμός και τι απομόνωση ενζύμου;

Answer 1

Καθαρισμός: εμπλουτισμός του διαλύματος/σκευάσματος ως προς συγκεκριμένο ένζυμο
Απομόνωση: καθαρισμός έως ότου μόνο το εν λόγω ένζυμο υπάρχει στο διάλυμα/σκεύασμα

Question 2

Κριτήρια καθαρισμού και απομόνωσης

Answer 2

1) Καλύτερη πηγή
2) Γνώση ως προς την συγκεκριμένη πρωτεΐνη
3) Πόσο καθαρό πρέπει να είναι το τελικό αποτέλεσμα (η έκτααση του καθαρισμού εξαρτάται από την τελική χρήση του ενζύμου)
4) Πόση ποσότητα καθαρής πρωτεΐνης απαιτείται
5) Πόση η επιθυμητή διάρκεια καθαρισμού
6) Πόσο το επιθυμητό κόστος καθαρισμού

Question 3

Εκλογή μεθόδου καθαρισμού

Answer 3

1) Γρήγορη και ειδική ως προς την συγκεκριμένη αντίδραση που καταλύει το ένζυμο
2) MUST προσδιορισμός της ενζυμικής δράσης για την εκτίμηση της απόδοσης, του εμπλουτισμού και καθαρισμού κάθε σταδίου

Question 4

Κριτήριο επιλογής πηγής ενζύμου

Answer 4

1) Διαθεσιμότητα πηγής (επαρκής για όλη την διάρκεια των πειραμάτων)
2) Περιεκτικότητα της πηγής σε ένζυμο
3) Γενετική ομοιογένεια της πηγής
4) Υποκυτταρική εντόπιση/κλασμάτωση

Question 5

Ποιο το 1ο στάδιο εκχύλισης ενζύμων;

Answer 5

1ο στάδιο: το σπάσιμο του κυτταρικού τοιχώματος/μεμβράνης προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών

Ζωικά κύτταρα:
ομογενοποίηση με ειδικούς ομογενοποιητές, σε συγκεκριμένο pH (συνήθως κοντά στο 5)

Φυτικά κύτταρα (πιο σκληρό τοίχωμα, απαιτούνται δραστικότερες συνθήκες):
λειοτρίβηση με καθαρή άμμο, υπέρηχοι, πέψη με ένζυμα π.χ. λυσοζύμη

Question 6

Φυσικές μέθοδοι εκχύλισης ενζύμων

Answer 6

-Ομογενοποίηση
-Λειοτρίβηση με καθαρή άμμο
-Υπέρηχοι σε διαλύματα αλκαλικά/χαμηλής ιονικής ισχύος επιταχύνουν τη λύση των μεμβρανών

Question 7

Χημικές μέθοδοι εκχύλισης ενζύμων

Answer 7

Διαλυτοποίηση:
1) Με διαλύματα χαμηλής Ι.Ι. σε αλκαλικό pH
2) Με πυκνά διαλύματα αλάτων κ ουρίας (σειρά Hofmeister)
! enzyme must return to previous condition after solution is removed
3) Με διαλύματα χηλικών παραγόντων που δεσμεύουν τα δισθενή κατιόντα των μεμβρανών (Ca2+, Mg2+)
4) Με οργανικούς διαλύτες πχ ακετόνη, που διαλυτοποιούν τα λιποειδή των μεμβρανών/αποδιατάσσουν τη διάταξη των λιπιδίων
5) Με απορρυπαντικά πχ χολικό νάτριο: both hydrophile (remain in the solution) and hydrophobic (bind to lipoids) groups
6) Με χημική τροποποίηση της δομής
-εισαγωγή νέων χημικών ομάδων (μηλεϊνικός
ή ηλεκτρικός ανυδρίτης με ε-NH2 Lys)
-ενζυμική υδρόλυση λιποειδών μεμβράνης με λιπάσες
φωσφολιπάσες κ πρωτεάσες

Question 8

Ποιοι παράμετροι πρέπει να λαμβάνονται υπόψιν για τον καθαρισμό ενός ενζύμου;
(Είναι εφτά και φωνάζουν δυνατά)

Answer 8

1) Δομή και λειτουργία του
2) Ιδιότητες (διαλυτότητα, υδροφοβικότητα, μοριακή μάζα, pI, ανθεκτικότητα σε ακραίες συνθήκες, συγγένεια με υποστρώματα, ευαισθησία σε θερμοκρασίες και οξειδωτικές συνθήκες)
3) Ποιο το είδος των προσμίξεων που πρέπει να αφαιρεθούν (λιπίδια, πολυφαινόλες, νουκλεϊκά οξέα)
4) Κόστος διεργασίας
5) Ταχύτητα διεργασίας
6) Απλότητα διεργασίας
7) Δυνατότητα scale up

Question 9

Μέθοδος καθαρισμού 1:
Κλασματική καθίζηση με αλάτια

Answer 9

ΧΡΗΣΗ: καθαρισμός, συμπύκνωση ενζυμικών διαλυμάτων
Συνήθως θειικό αμμώνιο
1. Προσθήκη σε:
-στερεή μορφή
-χαμηλή θερμοκρασία
-με διαρκή ανάδευση
για να πετύχουμε τον κατάλληλο κορεσμό
2. Φυγοκέντρηση
3. Διήθηση
4. Add more salt στο υπερκείμενο για καλύτερο κορεσμό

Question 10

Μέθοδος καθαρισμού 2:
Κλασματική καθίζηση με οργανικούς διαλύτες

Answer 10

Συνήθως αιθανόλη κ ακετόνη (πιο ισχυρός αφυδατικός παράγοντας, επικύνδινη για τη δομική ακεραιότητα των ενζύμων)
όσο μεγαλώνει η ανθρακική αλυσίδα 1οταγών αλκοολών μικραίνει η ικανότητα κατακρήμνησης πρωτ, μικραίνει ο κίνδυνος μετουσίωσής τους

PROS:
- Χαμηλότερη πυκνότητα από τα δ/τα αλάτων => απαιτούνται μικρότεροι χρόνοι/ταχύτητες φυγοκέντρησης
- Εκλεκτική καθίζηση πρωτ παρουσία ηλεκτρολυτών σε χαμηλές συγκεντρώσεις

CONS:
- Μεγάλη αύξηση του παρασκευάσματος σε όγκο
- Μεγάλη αύξηση της θερμοκρασίας με κίνδυνο μετουσίωσης των πρωτ

Question 11

Μέθοδος καθαρισμού 3:
Προσρόφηση

Answer 11

-Από δυσδιάλυτα άλατα (πχ φωσφορικό ασβέστιο, υδροξυαπατίτης) που προσροφούν στην επιφάνειά τους πρωτ
-Εκλεκτική προσρόφηση ως προς συγκεκριμένο ένζυμο έναντι αδρανών πρωτ ή το αντίθετο

Question 12

Μέθοδος καθαρισμού 4:
Κλασματική καθίζηση με μεταβολή του pH

Answer 12

Βάσει του γεγονότος ότι στο pI τους οι πρωτ έχουν μηδενικό φορτίο και min διαλυτότητα, ρυθμίζουμε το pH για να τις κατακρημνίσουμε επιλεκτικά

Question 13

Μέθοδος καθαρισμού 5:
Κλασματική καθίζηση με θέρμανση

Answer 13

Για ένζυμο ανθεκτικό σε υψηλές θερμοκρασίες, κατακρημνίζονται όλα τα υπόλοιπα στο διάλυμα με μετουσίωση

Question 14

Μέθοδος καθαρισμού 6:
Χρωματογραφία στήλης

Answer 14

Βάσει της διαφορετικής κατανομής πρωτ μεταξύ κινητής και σταθερής φάσης
Ανάλογα με το διαφορετικό μέγεθος, φορτίο και αγχιστεία ως προς άλλα μόρια
Οι πιο αποτελεσματικές

Question 15

Μέθοδος καθαρισμού 6.1:
Χρωματογραφία μοριακής διήθησης

Answer 15

Βάσει του διαφορετικού μεγέθους
Σε ορισμένες πρωτ επιτρέπεται η διέλευση από τους πόρους δυσδιάλυτων πολυμερών (πχ δεξτρόζη, αγαρόζη, πολυακρυλαμίδιο), ενώ σε άλλα όχι
Τα μεγάλα μόρια που δεν εισέρχονται στους πόρους εκλούονται πρώτα, ενώ τα μικρά που εισέχονται καθυστερούν και εκλούονται τελευταία

Question 16

Μέθοδος καθαρισμού 6.2:
Χρωματογραφία Ιονανταλλαγής

Answer 16

Βάσει του διαφορετικού φορτίου των πρωτ
Ρυθμίζοντας το pH και την Ι.Ι. των ρυθμιστικών διαλυμάτων
Χρησιμοποιούνται υποκατεστημένες κυτταρίνες ως ανταλλάκτες
πχ κατιονικός ανταλλάτης DEAE - cellulose (διαιθυλαμινοαιθυλο-)
και ανιονικός CM - cellulose (καρβοξυμέθυλο-) και τα αντίστοιχα πολυδεξτράνια

και έτσι αν το πολυμερές είναι αρνητικά φορτισμένο, μία θετικά φορτισμένη πρωτ δεσμεύεται από τους κόκκους του, ενώ μία αρνητικά φορτισμένη περνά με απλή ροή και εκλούεται πρώτη

Question 17

Μέθοδος καθαρισμού 6.3:
Χρωματογραφία προσρόφησης

Answer 17

Διαχωρισμός βάσει της ικανότητας προσρόφησης της πρωτ σε αδιάλυτο φορέα

Question 18

Μέθοδος καθαρισμού 6.4:
Χρωματογραφία αγχιστείας

Answer 18

Βάσει της αγχιστείας ή μη του ενζύμου για τον προσδέτη που είναι καθηλωμένος στη στερεή φάση
πχ αγχιστεία ενζύμου-αναστολέα / ορμόνης-υποδοχέα / αντιγόνου-αντισώματος
Και μετά το ένζυμο εκλούεται:
-αυξάνοντας την Ι.Ι. του διαλύματος έκλουσης
-χρησιμοποιώντας για έκλουση διάλυμα του προσδέτη (οπότε η πρωτ αποσυνδέεται από τη στερεά φάση και παρασύρεται μαζί του)

Question 19

Μέθοδος καθαρισμού 7:
Ηλεκτροφόρηση

Answer 19

Διαχωρισμός βάσει της κίνησης των φορτισμένων πρωτ υπό την επίδραση ηλεκτρικού φορτίου πάνω σε πηκτή αγαρόζης (μέγεθος πόρων ανάλογο της συγκέντρωσης ακρυλαμιδίου)
Προσθήκη απορρυπαντικών (πχ υψηλές συγκεντρώσεις ουρίας) που αποδιατάσσουν τις πρωτ (που μπορεί να έχουν ανώτερη δομή) στις επιμέρους πεπτιδικές τους αλυσίδες
Κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες η κινητικότητα των μορίων είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογαρίθμου του MW τους => οι μικρότερες μετακινούνται ταχύτερα προς την άνοδο
Ισοηλεκτρική εστίαση: (ειδική συνθήκη ηλεκτροφόρησης)
Σταθερή διαβάθμιση pH στο περιβάλλον κίνησης
Όταν η πρωτ φτάσει σε pH ίσο με το pI της ακινητοποιείται

Question 20

Καθαρότητα και Απόδοση σύμφωνα με το πρωτόκολλο καθαρισμού

Answer 20

Καθαρότητα: ειδική δραστικότητα σταδίου / ειδική δραστικότητα αρχικού παρασκευάσματος
Απόδοση: το ποσοστό της ενζυμικής ενεργότητας που παραμένει μετά από κάθε στάδιο καθαρισμού, αν η αρχική περιεκτικότητα ήταν 100%

Question 21

Καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Answer 21

Διαδικασία:
-Απομόνωση του εν λόγω γονιδίου ή cDNA
-Έκφραση της πρωτ σε υψηλά επίπεδα (μεγάλος αριθμός πλασμιδίων, ισχυρός προαγωγέας για επαγωγή της έκφρασης)
-Καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτ από τα κύτταρα του ξενιστή ανάλογα με την υποκυτταρική της εντόπιση (αν βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, το εξωκυττάριο υγρό, σε μεμβράνες ή έγκλειστα σωματίδια)

PROS: Αυξάνεται σε μεγάλο βαθμό το επίπεδο της πρωτ στο αρχικό εκχύλισμα

CONS:
-Η υπερέκφραση δεν είναι σε διαλυτή/δραστική μορφή
-Χρησιμοποιούνται μετουσιωτικές ουσίες (πχ ουρία, γουανιδίνη) που μπορεί να καταστρέψουν τη δομή των πρωτ
-Η επαναδιάταξή τους πρέπει να γίνεται πολύ σταδιακά σε πολύ αραιά διαλύματα και μετά απαιτείται έξτρα συμπύκνωση και κατακρήμνιση της πρωτ

Question 22

Πρωτεΐνες σύντηξης

Answer 22

PROS:
-Βελτιωμένη σταθερότητα πρωτ
-Βελτιωμένες ιδιότητες πρωτ
-Ευκολότερη/γρηγορότερη απομόνωση πρωτ
-Μεγαλύτερες ποσότητες παραγόμενης πρωτ

πχ. σύντηξη του επιθυμητού γονιδίου με το γονίδιο της τρανσφεράσης της GSH και χρήση της GSH ως προσδέτη στο υλικό πλήρωσης της στήλης (χρωματογραφία αγχιστείας)

Question 23

Στόχοι Ενζυμομηχανικής

Answer 23

Ενζυμομηχανική: σχεδιασμός και κατασκευή ενζύμων με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA
1. Βελτίωση της καταλυτικής δράσης και της εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα
2. Τροποποίηση της εξειδίκευσης ως προς υπόστρωμα => νέα ένζυμα καταλύουν νέες αντιδράσεις
3. Τροποποίηση με μεταβολή του pH (διαφορετικό βέλτιστο/δράση σε ακραίες τιμές)
4. Αύξηση της αντοχής σε οξειδωτικά αντιδραστήρια (πχ αν περιέχουν Met-Cys-Trp κοντά στο ενεργό κέντρο είναι πολύ ευαίσθητα
5. Αύξηση της αντοχής σε υψηλές θερμοκρασίας, ειδικά αν πρχ δισουλφιδικούς
6. Αύξηση της αντοχής του ενζύμου σε πρωτεόλυση
7. Σταθερότητα ενζύμου και διατήρηση καταλυτικής δράσης σε μη υδατικά διαλύματα
8. Μείωση των αλλοστερικών κέντρων που μπορούν να προσδέσουν παρεμποδιστές της δράσης του ενζύμου, πχ το προϊόν (μηχανισμός ανάδρασης)
9. Ενσωμάτωση ενζύμων σε μία πρωτ με πολλαπλά ενεργά κέντρα
10. Παραγωγή καταλυτικών αντισωμάτων/ αντινοηματικών μορίων RNA

Question 24

Εφαρμογές ενζυμομηχανικής

Answer 24

Α. Μελέτη δομής/λειτουργίας των ενζύμων
Β. Εισαγωγή ομάδων αναφοράς στο ένζυμο
Γ. Βιομηχανικές εφαρμογές
Δ. Εφαρμογές σε κλινική χημεία/χημειοθεραπεία