Determination of Enzymes

Question 1

Κριτήρια επιλογής ενζυμικών αντιδράσεων

Answer 1

1. Προσθήκη εκχυλίσματος αυξάνει την ταχύτητα αντίδρασης
2. Ο καταλύτης παραμένει αναλοίωτος και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί σε νέα αντίδραση
3. Πολύ μικρές ποσότητες καταλύτη
4. Ειδίκευση του καταλύτη ως προς την αντίδραση που καταλύει
   (π.χ. φωσφατάση + 1-Ρ γλυκόζη + 6-Ρ γλυκόζη + 3-Ρ γλυκερινικό —> γλυκόζη + γλυκερινικό + ορθοφωσφορικά)
5. Ο καταλύτης μπορεί να δηλητηριαστεί από μικρές ποσότητες πχ αρσενικού, φωσφορικών, φθοριούχων

Question 2

Μονάδα ενζυμικής δράσης

Answer 2

Το ποσό του ενζύμου που μετατρέπει 1μmol υποστρώματος σε 1min κάτω από καθορισμένες, βέλτιστες συνθήκες.
U = μmol/min
Katal = mol/sec

Question 3

Ειδική δραστικότητα/καθαρότητα ενζύμου

Answer 3

Οι μονάδες ενζυμικής δράσης ανά βάρος πρωτεΐνης
U/mg
Kat/kg
Αποτελεί μέτρο της καθαρότητας ενός ενζύμου

Question 4

Μοριακή δραστικότητα

Answer 4

Οι μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ανά mol ενζύμου για βέλτιστη λειτουργία υποστρώματος (πόσα μόρια υποστρώματος μετατρέπονται σε προϊόν ανά μόριο ενζύμου ανά sec)
Αποτελεί μέτρο της καταλυτικής δραστικότητας του ενζύμου, και συχνά αναφέρεται στα καταλυτικά του σημεία και όχι στο σύνολο.

Question 5

Συνεχείς μέθοδοι προσδιορισμού

Answer 5

Το υπόστρωμα και το προϊόν πρέπει να διαφέρουν σε μία τουλάχιστον παράμετρο (φθορισμομετρία, φασματοφωτομετρία, πεχαμετρία).
Η καμπύλη συναρτήσει του χρόνου είναι καθορισμένη, κάθε ανωμαλία μπορεί να αναγνωριστεί

Question 6

Ασυνεχείς μέθοδοι προσδιορισμού

Answer 6

Η αντίδραση σταματά με κάποιο τρόπο (αλλαγή pH, T) ή αδρανοποιείται το ένζυμο, και το υπόστρωμα απομακρύνεται από το προϊόν ή προστίθεται μία χρωμοφόρος ένωση που αντιδρά μαζί του και επιτρέπει τον χρωματομετρικό προσδιορισμό του.
Το σχήμα της καμπύλης μπορεί να ποικίλλει και οι διάφορες ανωμαλίες να προκύψουν από σφάλματα στον χρόνο τερματισμού ή στην απομάκρυνση δειγμάτων

Question 7

Άμεσοι μέθοδοι προσδιορισμού

Answer 7

Προσδιορίζεται άμεσα είτε το υπόστρωμα που περίσσεψε, είτε το προϊόν που παράχθηκε
π.χ. οξειδάση της ξανθίνης (ξανθίνη—>ουρικό οξύ) με μέτρηση της απορρόφησης στα 290nm

Question 8

Έμμεσες μέθοδοι προσδιορισμού

Answer 8

Η κύρια ενζυμική αντίδραση συζεύγνυται με άλλες (μία ή περισσότερες), έτσι ώστε να προσδιορίζεται το προϊόν της τελευταίας, το οποίο βρίσκεται σε στοιχειομετρική σχέση με το προϊόν της πρώτης.
π.χ.
Glycerine +ATP —> P-Glycerine +ADP
ADP + PEP —> Pyruvate + ATP
Pyruvate + NADH+ —> Lactic acid + NAD+ (LDH)
και παρατηρείται πτώση απορρόφησης στα 340nm

Question 9

Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι

Answer 9

Βάσει του νόμου Lambert-Beer A=ε c d
Οι πιο εύχρηστες και εφαρμόσιμες μέθοδοι
Προϋποθέσεις:
-Το υπόστρωμα ή κάποιο/α από τα προϊόντα πρέπει να απορροφά στο UV-Vis
-Η εξαφάνιση του υποστρώματος/εμφάνιση προϊόντος να προκαλεί σημαντική μεταβολή στο φάσμα

π.χ. LDH με NAD+ μόνο μέγιστο στα 260nm ενώ με NADH έξτρα κορυφή στα 340nm

Question 10

Φασματοφθορισμομετρικές μέθοδοι

Answer 10

Βάσει της ικανότητας ορισμένων ενώσεων να απορροφούν σε ορισμένο λ, να διεγείρονται, και μετά να εκπέμπουν φθορισμό σε μικρότερο λ.
π.χ. NADH, NADPH απορροφούν στα 340nm και εκπέμπουν στα 460nm

-100φ πιο ευαίσθητη από τη φασματοφωτομετρική
-επιρρεπής σε αλλαγές της θερμοκρασίας
-εφαρμόζεται μόνο στην ορατή περιοχή

Question 11

Ηλεκτροχημικές μέθοδοι

Answer 11

Βάσει της απελευθέρωσης όξινων προϊόντων κατά τη διάρκεια της αντίδρασης
Χρησιμοποιείται ηλεκτρόδιο υάλου είτε για μέτρηση της μεταβολής στην τιμή του pH, είτε με ταυτόχρονη τιτλοδότηση ώστε το pH να παραμένει σταθερό.
π.χ. στον προσδιορισμό της λιπάσης

BUT:
-Αλλαγή στο pH => αλλαγή στη δραστικότητα του ενζύμου
-Ο ρυθμός μεταβολής του pH επηρεάζεται από τη ρυθμιστική χωριτικότητα του διαλύματος

Question 12

Πολωσιμετρικές μέθοδοι

Answer 12

Όταν το υπόστρωμα είναι οπτικά ενεργό και τα προϊόντα όχι ή το αντίθετο, ή όταν στρέφουν το πολωμένο φως προς διαφορετική κατεύθυνση
Προσδιορίζεται η δραστικότητα του ενζύμου από την περιστροφή του πολωμένου φωτός, και η μεταβολή της ειδικής στροφικότητας με το χρόνο

π.χ. Sucrose + H2O —> D-Glucose + D-Fructose
aD(20)= +66.5 aD(20)= -39.8

Question 13

Χημικές μέθοδοι

Answer 13

Κατάλληλο αντιδραστήριο αντιδρά με το υπόστρωμα που περίσσεψε ή με το προϊόν που παράχθηκε. (=> κάποιο ορατό αποτέλεσμα/διαφορά)

π.χ. (1) για τις φωσφατάσες, προσδιορισμός των ανόργανων φωσφορικών που παράγονται

π.χ. (2) για την υδρόλυση του DNA με νουκλεάσες:
-προσθήκη τριχλωροοξικού οξέος για να κατακρημνυστεί το ένζυμο και τα πολυνουκλ
-τα νουκλ που έμειναν διαλυτά προσδιορίζονται με διφαινυλαμίνη
-το νέο μείγμα που πρχ δεοξυριβόζη απορροφά στα 595nm ενώ αρχικά το μείγμα DNA θα ήταν στα 260nm

Question 14

Μανομετρικές μέθοδοι

Answer 14

Όταν το προϊόν της αντίδρασης είναι αέριο π.χ.CO2
Σε κλειστό σύστημα, έτσι ώστε η αύξηση της πίεσης να είναι ανάλογη της ταχύτητας αντίδρασης

Question 15

Χρωματογραφικές και ηλεκτροφορητικές μέθοδοι

Answer 15

Only when we’ve run out of options.
Πολύπλοκες, χρονοβόρες, δύσκολος καθαρισμός ενζύμου

Question 16

Ισοτοπικές μέθοδοι

Answer 16

Χρησιμοποιούνται ραδιενεργά σεσημασμένα υποστρώματα
όταν έχουμε πολύ ασθενείς ενζυμικές αντιδράσεις, ή πολύ μικρούς όγκους αντίδρασης, ή δεν θέλουμε πιο πολύπλοκη μέθοδο
π.χ. αποκαρβοξυλίωση της ορνιθίνης με σεσημασμένο 14C.

Question 17

Μέθοδος HPLC

Answer 17

Υψηλή διαχωριστική ικανότητα
Πολύ γρήγορη
Πολύ ευαίσθητη
Διαχωρισμός με ιονανταλλαγή, βάσει μεγέθους ή με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις
Ισοκρατική με έναν διαλύτη έκλουσης, διαβαθμισμένη με αυξανόμενες συγκεντρώσεις διαλύτη
Ανίχνευση με UV-Vis, φθορισμό, ραδιοχημικά κλπ