Électrophorèse

Question 1

Qu’est-ce que l’électrophorèse?

Answer 1

Migration de particules chargées électriquement sous l’effet d’un champ électrique.

Question 2

Quelle est l’équation de la vitesse de migration?

Answer 2

V = (E x q) / f

V = vitesse de déplacement de l’ion

E = potentiel du champ électrique (Volts)

q = charge portée par l’ion

f = coefficient de friction : variable dépendante de la masse (taille), de la forme de la molécule, et de la viscosité du milieu.

Question 3

Quelles sont les caractéristiques du gel de polyarcylamide? Pour quoi est-il utilisé? En quelles conditions?

Answer 3

Gel : mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide.

Utilisation : pour les acides nucléiques de petites tailles, et les protéines.

Gel non chargé et inerte.

Conditions dénaturantes ou non dénaturantes.

Question 4

Quelle est la différence de structure entre le gel d’acrylamide et de bis-acrylamide?

Answer 4

Acrylamide : juste un groupement

Bis : deux mêmes groupements dans une molécule

Question 5

Comment se produit la polymérisation de l’acrylamide?

Answer 5

Elle se fait de façon linéaire.

Question 6

Comment se produit la polymérisation d’acrylamide en présence d’un agent réticulant?

Answer 6

De la même façon mais peut mener à la formation de pont. Cela forme un gel poreux.

Question 7

Quelle est la gamme de séparation des molécules en fonction de leur masse moléculaire ainsi que le % d’acrylamide dans le gel?

Answer 7

Plus il y a d’acylamide, plus les protéines séparées auront une petite masse moléculaire. La migration sera plus rapide.

Question 8

La taille des pores dans le gel dépendent de quoi?

Answer 8

La taille des pores dépend du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide et de la proportion acrylamide/bis-acrylamide

Question 9

Quel est le rôle des radicaux libre dans la polymérisation du gel de polyacrylamide?

Answer 9

Ces radicaux libres sont fournis au mélange d’acrylamide par le persulfate d’ammonium, qui sert d’initiateur de la réaction.

Question 10

Quel est le rôle du TEMED dans la polymérisation du gel de polyacrylamide?

Answer 10

Le TEMED (tetramethylethylenediamine) est aussitôt rajouté au mélange après les radicaux libres afin d’accélérer la réaction de polymérisation.

Question 11

Pourquoi faut-il couler rapidement le gel une fois les composants mis dedans?

Answer 11

Car sa solidification débute 20 à 30 secondes après le mélange.

Question 12

Quelles sont les deux dimensions d’une électrophorèse 2D?

Answer 12

Électrophorèse à deux dimensions (2D) :

1) Électrophorèse par isofocalisation (1ère dimension), séparation par charge
2) SDS-PAGE deuxième dimension, séparation par taille

Question 13

Quelles sont les caractéristiques d’une électrophorèse en conditions natives? De quoi dépend la séparation? Pourquoi l’utilise-t-on?

Answer 13

La séparation dépend de la charge nette, de la structure et de la taille des protéines.

Ce type de séparation est privilégiée lorsque la structure de la protéine doit être conservée

Études structurales, études fonctionnelles et études enzymatiques

Question 14

Qu’est-ce que le point isoélectrique?

Answer 14

Correspond au pH pour lequel la somme des charges + et – d’une protéine s’annule : la charge nette est nulle (autant de charges positives que négatives).

Si le pH est plus petit que le pI, la protéine est chargée positivement. Si le pH est plus grand que le pI, la protéine est chargée négativement.

Question 15

Lors d’une séparation par charge, quand est-ce qu’une protéine va arrêter de migrer?

Answer 15

Lorsqu’elle va avoir atteint son pI

Question 16

Quelles sont les caractéristiques de l’électrophorèse en conditions dénaturantes? Qu’est-ce qu’elle permet?

Answer 16

Uniformisation de la forme et de la densité de charge avec un détergent anionique (SDS: Sodium Dodécyl-Sulfate)

Séparation selon la masse moléculaire uniquement

Permet la détermination de la masse moléculaire apparente des protéines

Permet de déterminer le nombre de sous-unités d’une protéine

Permet de déterminer la pureté d’un échantillon

Question 17

Que sont les structures primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines?

Answer 17

Primaire : enchaînement des aa

Secondaire : structure petite partie de la chaîne (hélice ou feuillet)

Tertiaire : structure de la sous unité au complet

Quaternaire : structure de toutes les sous unités de la protéine

Question 18

Qu’est-ce que la dégradation des protéines?

Answer 18

C’est par la coupure de la structure primaire avec des protéases. On perd la structure primaire et c’est irréversible.

Question 19

Qu’est-ce que la dénaturation ?

Answer 19

C’est l’augmentation de la température ou un changement de pH. Cela fait en sorte que la protéine perd ses structures quaternaire et tertiaire. C’est parfois réversible.

Question 20

Quels sont les 3 agents dénaturants pour les protéines? Quels sont leurs effets?

Answer 20

Chaleur, pH : déplie et linéarise les molécules. Afin compléter la dénaturation, on a besoin également un court traitement à la chaleur, généralement à 90-100°C

Sodium Dodécyl-Sulfate: recouvre les molécules de charges négatives

β-mercaptoéthanol + chaleur : rupture des ponts disulfures formé entre les résidus Cys un réducteur très utile

Question 21

Quelle quantité de SDS a-t-on besoin par rapport à la quantité de protéine?

Answer 21

1,4g de SDS pour 1g de protéines

Question 22

Quelle est la conséquence de l’interaction SDS avec les protéines?

Answer 22

Il y a perte des structures tertiaires et quaternaires

1,4 g de SDS/g de protéine (1 SDS pour 2 acides aminés environ)

Crée une densité de charge uniforme

Question 23

Quel est l’effet du β-mercaptoéthanol sur les protéines?

Answer 23

Rupture des ponts disulfures (en présence de ß-ME +chaleur) intra-peptide et interpeptide.

Question 24

Quelle est la différence entre un système continu et un système discontinu avec SDS-PAGE?

Answer 24

Système continu : Un seul gel de polyacrylamide et un seul système de tampon.

Système discontinu : Superposition de deux gels de polyacrylamide:

Gel de concentration / d’empilement (2-4%).

Gel de résolution / de séparation (7-15%).

Deux tampons de pH différent.

Permet de concentrer les échantillons en une fine bande, pour une meilleure résolution.

Question 25

Quel est l’ordre des composants qui vont le plus vite lors de migration sur système discontinu?

Answer 25

Les ions Cl- sont les plus rapides. Ils sont suivis par les protéines qui sont suivies par les ions glycines.

Au contact du ≪ gel de séparation ≫ (pH 8.8), les ions glycines redeviennent chargées négativement. Étant plus petites que les protéines elles migrent alors plus rapidement.

Question 26

Quel est le marqueur utilisé pour le bleu de Coomassie?

Answer 26

Le standard broad range

Question 27

Qu’est-ce que l’isofocalisation?

Answer 27

La séparation selon le pI des protéines. Chaque protéine arrête de migrer lorsque pH = pI. On connaît alors le pI de la protéine