Do VL 7-8 Flashcards
Zink-Finger-Nukleasen!
basieren auf Fok I aus einem Flavobakterium!
• es hat eine DNA-bindende-Domäne und eine Nuklease-Domäne!
• DNA-bindende-Domäne ! —> Zink-Finger!
• jeder Zink-Finger erkennt eine bestimmte Sequenz (meist aus 3 Basen)!
! —> man kann diese Zink-Finger modulieren ! ! ! !
! —> so kann man genau die Schnittstelle der Nuklease-Domäne bestimmen! !
! —> dort bietet man homologes Stück mit Mutation an ! ! ! ! —> wird eingebaut!
! !
! ! ! !
• Problem: ! !
spalten auch häufig woanders, ! ! ! ! oft sind die synthethisch modulierten Finger !toxisch, ! auch die Programmierung ist oft schwierig!
TALEN
transcription activator like effector nuclease!
• Grundlage ist TALE (Transkiptionsraktivatoren)! ! —> DNA-bindendes-Protein!
• Modul: ! 34AS ! —> erkennt ein Nukleotid (welches Nukleotid liegt an AS12 und 13)! • wenn 12 ein Asparagin und 13 auch, dann wird G gebunden!
• Asn-Ile ! —> A!
• His-Asp ! —> C!
•Asn-Gly!—>T
! —> Protein lässt sich gut designen, da es eine klare Zuordnung gibt!
! !
! ! ! !
12
• nach den AS Sequenzen, am Ende eine Fusion mit Nuklease! ! ! ! ! ! —> viel bessere Korrelation zwischen AS Sequenz und Nukleotidsequenz!
• Schwierigkeit liegt in der Klonierung der Sequenzen, !
- weil starke Homologenität zwischen den Stücken (unterscheiden sich ja nur in den zwei
AS)!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
! —> Bakterien klonieren diese repetitiven Sequenzen nicht sehr gut!
• in hohen Eukaryoten brauch man eine Methylierung an den Nukleotiden ! ! !
! —> Bakterien klonen diese nicht !
Crispr/Cas9!
• RNA-guided engineered nucleases!
• Zielsequenz der Endonucleasen wird durch eine RNA bestimmt!
• Komponenten:!
- CRISPR — clusted regulary interstaced palindromic repeats! > repeats mit bestimmten Sequenzen dazwischen !
> diese best. Sequenzen sind Virensequenzen!
- vor dem CRISPR liegen die CRISPR assoziated genes (Cas Operon)!
- Cas 9 ist eine Nuklease (hat 2 Nukleasen HNH, RaVC)!
- tracer RNA!
• aus dem CRISPR wird RNA gemacht und daraus DNA! ! ! ! !
- genau diese DNA Sequenzen (spacer sequenz) werden dann bei Viren erkannt und
geschnitten (durch Cas9)!
• Cas1, Cas2 ,Cas3 sind dafür da kleine Stücken der neuen Viren dort einzubauen!
- man kann die RNA synthetisch herstellen und Cas9 schneidet dann genau dort, sehr spezifisch!
• es wird aber noch eine 2. RNA gebraucht damit das targeting gut funktioniert —> tracer RNA! - tracer RNA und crRNA werden dann fusioniert, damit man alles auf einer RNA hat !
- = sgRNA (single guide RNA) !
• davon muss man aber immer nur die Zielsequenz also die crRNA ändern!
• man macht also Cas9 + sgRNA und bringt diese in einen Organismus ein !
- mit den Schnitten durch CRISPR/Cas9 kann man dann Homologe Rekombination oder non homologe end joining vollziehen!
• man könnte auch Cas9 mutieren und das nur einer der zwei Nukleasen in Cas9 arbeitet !
! —> man hat keinen DSB!
Methoden der Humangenetik
- Zytogenetik und molekulare Genetik!
- Karyogramm —> Anzahl, Größe, Sichtbare Unterschiede der Chr! - Zwillingsforschung!
- gibt es unterschiede in der Ausprägung von Merkmalen bei eineiigen?! - Stammbäume!
- Vererbung von Merkmalen überprüfen!
Zytogenetik!
Karyogramm erstellen!
- man benötigt Zellen/Chr in der Metaphase!
- durch Behandlung mit Kolchicin —> arritiert Zellen in Metaphase!
- ausbreiten von Zellen auf Objektträger, Chr anfärben heraus sortieren und gruppieren! - Gruppierung nach Länge oder Zentromer!
• Bandenmuster der angefärbten Chr sind spezifisch für Chr! —> man kann so Translokationen erkennen
• Chromosomen!
- kurzer Arm „p“!
- langer Arm „q“!
- je größer Chr, desto mehr Gene drauf!
• Chromosomen-Aberrationen (Fehler)! - zB Fehlen oder zusätzliches Chr! - Trisomie:!
! >3Chr!
! > nur bei Chr21 toleriert, sonst letal —> führen zu Abort!
! > wahrscheinlich weil auf 21 weniger Gene sind als auf zB 22!
• Fluoreszenz in-sitro Hybridisierung — FISH!
- ein Stück den Chr wird fluoreszenzmarkiert!
- chromosomenspezifische, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden!
- so kann man kleine Änderungen (zB Translokation) erkennen bzw. auch überprüfen, ob
diese vorliegen!
Zwillingsforschung!
• eineiige (monzygot) und zweieiige (dizygot)!
- zweieiige de facto Geschwister; waren aber zur gleichen Zeit im Uterus! - eineiig genetisch identisch!
• Vergleich von mono- und dizygot um abzuschätzen, wie viel Bedeutung die Umgebung hat auf Ausprägung von Phänotyp!
• Konkurdanz/Diskordanz —> Erblichkeit von Merkmalsausprägungen!
!• Daraus kann man auf die Erblichkeit eines Merkmals schließen
Probleme um genetische Komponente in Famielenstammbäume zu erkennen!
Polygenie / Multifaktoriell!
- Merkmal wird durch mehrere Allelvarianten kodiert!
• Penetranz!
- Person besitzt mutiertes Allel, Merkmal prägt sich jedoch nicht aus! - Ausprägung variiert zw Individuen!
• Verzögerte Ausprägung eines Merkmals! - bspw Huntington!
• Mutationen auf mitochondrieller DNA / mitochondrielle Vererbung! - wird nur von Frauen vererbt!
• wenig Nachkommen!
- lassen wenig Rückschlüße auf Erkrankungen zu!
