Do VL 4 - 6

Question 1

Rekombinante DNA!

Answer 1

neues DNA-Molekül, dass durch Kombination von 2 nicht-homologen DNA-Fragmenten entstanden ist!

Question 2

Gentechnisch veränderter Org. (GVO)!

Answer 2

Org., der DNA-Seq eines anderen Org enthält und nicht durch Kreuzung hergestellt wurde!

Question 3

Isolierung genomischer DNA!

Answer 3

Anwendung!
- Ausgangmaterial für viele gen. Verfahren: Klonieren, Southern Blot, PCR!

DNA —> sehr labil bzgl pH, Temp!
Isolierung nur von Bruchstücken!
Extraktion unter milden Bedingungen (Gewebe homogenisieren, ionische Detergenzien)!
Anwesenheit eines Komplexbildners (EDTA) zur Komplexierung von Mg2+ und Mn2+ - Kofaktoren für DNAsen!
Proteine durch Proteolyse abbauen oder Phenol/Chloroformextraktion!
Alk-Fällung und Lagerung in TE (10mM Tris), 1mM EDTA!

Question 4

DNA-Gelektrophorese

Answer 4

Trennung über Agarose-Gel!

je größer, destro weniger weit laufen DNA-Fragmente!

Question 5

PCR

Answer 5

Amplifikation eines best. DNA-Bereichs, der durch 2 Oligonukleotide begrenzt wird!
• Taq-Pol:! 1000bp/min!
!• Taq synthetisiert von Primer an neuen Strang!

Question 6

Markierung von DNA

Answer 6

Anwendung Markierung für Hybridisierungsexp.! • Methode:! ! Einbau markierter Basenanaloga!
- -
Nick Translation!
! > durch DNAse1 werden Teilstücke entfernt und DNA-pol1 fügt nt (markierte) ein! Random Priming!
! > DNA denaturieren!
! > Primer binden!
! > DNA-Pol1 synthetisiert neuen Strang
Isolierung mRNA und cDNA-Synthese!
• Markierungen:!
- radioaktive Isotope (32P, 14C…)!
- nt, die modifiziert sind und von spez. Antikörper erkannt werden!
- nt, deren Basen mit Makromolekülen gekoppelt sind und die immunologisch nachgewiesen
werden!
- nt, die über eine Komplexbildung mit anderen Makromolekülen den Nachweis erlauben!

Question 7

Isolierung mRNA und cDNA-Synthese!

Answer 7

cDNA als Ausgangsmaterial für viele Exp.!
• Methode:! Aufreinigung von mRNA!
• Problem:! RNA ist sensitiv für RNAsen, diese benötigen kein Mg2+ als Kofaktor!
• Vorgehen:! Inaktivierung von Proteinen (+RNAsen) mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)! • Aufreinigung von mRNA aus RNA-Gemisch durch poly-dT-Oligo !
—> da polyA-Schwanz bei mRNA, fischt polyT-Oligo (Primer) diese raus! • Umschreiben von mRNA in DNA mit reverser Transkritpase!
=> cDNA ohne Introns!

Question 8

DNA-Klonierung

Answer 8

Ziel:! Einführen eines DNA-Abschnitts in ein geeignetes Vehikel (Vektor)!
• Werkzeuge:!
1. Restriktionsenzyme!
- Enzyme, die DNA an einer def. Seq. schneiden!
2. Vektoren!
- Vehikel, mit dessen Hilfe DNA in Wirtszelle eingebracht werden kann!

Question 9

Restiktionsenzyme

I. Klasse!

Answer 9

Erkennungsseq. 15bp!
• nur ersten und letzen 3 wichtig!
• spaltet unspizifisch ca 1000bp in 3’ Richtung!

Question 10

Restiktionsenzyme

II. Klasse!

Answer 10

schneiden innerhalb der E-Seq!
• E-Seq ist palendromisch (von vorn oder hinten lesbar (gleich))! • Länge palindromischen Seq oft 4, 6 bzw 8 Basen!
• schneidet oft zwischen den gleichen Basen !
! —> Überhang (3’ oder 5’-Überhänge, je nach Enzym versch.) —> sticky ends! !
5’—G|AATTC—3’!
! 3’—CTTAA|G—5’!
• einige schneiden auch ohne Überhänge —> blunt ends!

Question 11

Restiktionsenzyme

III. Klasse

Answer 11

• schneidet in def. Abstand zur Erkennungsseq!

Question 12

Vektoren Eigenschaften!

Answer 12

Aufnahme fremder DNA!
• autonome Vermehrung in Wirtszelle!
• Selektion von Wirtszelle mit Vektor oft durch Antibiotikum-Resistenzgen! • Bsp:! Plasmide, Bakteriophagen!
• je nach DNA-Sample-Größe gewählt!

Question 13

Plasmide!

Answer 13

• Replikationsursprung!
• Resistenzgen!
• Multiple Cloning Site (Polylinker, MCS)—> dort wird Wunsch-DNA einkloniert

Question 14

Gerichtete Klonierung

Answer 14

Vektor und Insert werden mit 2 unterschiedl. Restriktionsenzymen behandelt bzw linearisiert!

Question 15

ungerichtete Klonierung

Answer 15

beide mit einem behandelt!
• beiden Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors Kompatibel!
! —> Gen kann „falsch rum“ eingelagert wird nach zB TTA— oder —ATT! !

Question 16

Screening von Genbanken!

Answer 16

Isolierung eines vollst. Gens; cDNA; genom. DNA; Gens aus einem Org.; Gens oder einer cDNA aufgrund einer Proteinsequenzierung!

Question 17

Hybridisierung mit einer markierten Sonden!

Answer 17

einzelsträngige Nukleinsäuren —> doppelsträngig! ! DNA—DNA; DNA—RNA!

Question 18

Ziel genetischer Analyse

Answer 18

Fkt der Proteine !

!• wissen welche Gene an biol. Prozess beteiligt sind!

Question 19

Forward Genetics!

Answer 19

Prozess—Mutagenese—> Phänotyp —> Gen —> Protein!
- beliebiger biol. Prozess zB Fellfarbe Mäuse (wie entsteht sie?) [oder Hefe die nicht
mehr Lysin produzieren kann]!
- man überlegt sich einen Mutanten-Phänotyp zu dem untersuchenden Prozess!
- zB normal Schwarz — Mutante Grün!
- WT nehmen und durch Zufallsmutegenese mutieren lassen und den gewollten
Mutanten-Phänotyp herausfiltern!
- dann schauen, welches Gen mutiert ist und draus rückschließen, welches Protein
für die Ausprägung des WT-Phänotyps verantwortlich ist!

Question 20

Ziel Forward Genetics

Answer 20

möglichst alle Gene innerhalb eines Prozesses zu identifizieren!

Question 21

Probleme Forward Genetics

Answer 21

Gene unterschiedlich groß —> lange Gene besitzen höhere Wahrscheinlichkeit zu mutieren als kleinere (sind leichter mutierbar)! Pleiotropie — Mutation eines Genes gibt nicht nur einen sondern mehrere Phänotypen !
zB Fellfarbe: Gen für Fellfarbe besitzt auch andere Ph. (bspw. letal ! ! für Embryo —> Mutante nicht isolierbar)!

Question 22

• Mutagenese

Answer 22

eine gerichtete Mutation! Population von mutierten Org! Suche nach Phänotyp der Wahl!
a) genetische Selektion !— nur gewollte können überleben/wachsen!
b) genetischen Screen! — alle Mutanten wachsen; man muss alle überprüfen,
! ! ! ! welche gewünschten Ph. besitzen!

Question 23

reverse genetics

Answer 23

Prozess —> biochem. Assey —> Protein —> Gen —> Phänotyp (welchen Ph. bekomme ich, wenn ich Gen mutiere)!
ich suche best. Enzym über biochem. Ansatz (Assey)!
- bsp enzymatischen Assey!
- A—> B wird umgesetzt!
- wird so lange aufgereinigt (biochem.) (bzgl. der Aktivität die einen interessiert) bis
(im besten Fall) nur noch 1 Protein vorhanden ist!
- aus Aktivität des Protein kann man auf das Gen rückschließen!
umgekehrt, da man vom Gen auf Ph schließt!

Question 24

Methoden reverse genetics

Answer 24

Methoden!
(a) Gen-Knockout!
- Gen wird durch homologes Marker-Gen am linearen DNA-Molekül ausgetauscht, welches jedoch nicht kodierend ist!
- wenn Ph. den man dann erhält nicht zum Prozess passt (also zB trd AS-Seq. erhalten werden —> doof)!
Biosynthese!
(b) Zielgerichtete Mutagenese! (c) Genome Editing
(d) RNA-Interferenz!
(e) chemical Genetics/Genomics
- chem. Inhibitor der Aktivität eines best. Proteins!
- Genomics— Deletionsmutanten (Gen knockout) werden auf Supersensitivität
bzgl chem. Inhibitor untersucht!

Question 25

Southern Blotting!

Answer 25

DNA-Detektierung mH einer DNA-Sonde! • Schritte!

1. Restriktionsverdau von DNA!
2. Auftragung auf Gel!
3. transfer der DNA aus Gel auf Membran (feste Unterlage)!
   - da Membran physikalisch stabiler ist als Gel!
   - zB Nylonmembran; Nitrocellulose!
   - zeigt auf Membran, wie DNA vorher im Gel gelaufen ist!
4. Hybridisierung mit markierter Sonde!
   - 2 Komplementäre Einzelstränge!
   - zum Finden des Gens, welches mich interessiert!
   - die Sonde gibt man in Lösung (vorher ssDNA durch Erhitzen)!
   - Lösung wird durch Gel+Membran gezogen —> DNA wird auf Membran übertragen!
   - dort wo komplementäre Stränge sind im Gel, werden diese hybridiesiert und es gibt
   markierte Stellen in Membran!
   - Sonde ist radiomarkiert zB 32P!
5. Autoradiogramm —> schwärzen eines radio-Films an Stellen mit Sonde!

Question 26

Northern Blotting

Answer 26

Ergänzung zum Southern Blotting!
• RNA-Detektion mit DNA/RNA-Sonden! • äquivalent zu Southern!
!• Anzahl der überprüfbaren Proben abh. von Gel-Größe!

Question 27

Western Blotting

Answer 27

Protein-Detektion mit Antikörper(-Sonde)! !• Protein-Gel; ähnlich Southern!

Question 28

OMICS Technologie

Microarray!

Answer 28

Sonde befestigen auf Unterlage; Probe fest!
• Sonde mit kleinen „Pünktchen“ auf Objektträger (=Chip)!
- man kann viele Sonden auf kleinen Raum aufbringen und Probe auf versch. Gene prüfen!
- RNA wird reverse transkribiert —> DNA die man testet! • DNA wird in Probe fluoreszenzmarkiert!
- wenn DNA für Sonde in Probe, fluoresziert Sonden-Punktchen!
• Gesamt-RNA —> cDNA —> Markierung —> Hybridisierung auf Chip! • Signalintensität korreliert mit cDNA-Menge im Gemisch (Probe)!
• funktioniert auch mit mehreren Proben!
—> verschiedene Fluoreszenzmarker! • Sonden:!
- Oligonukleotide —> leicht synthetisierbar!
- werden zT gleich auf Chip synthetisiert —> printing!

Question 29

OMICS Technologie

• Tiling-Array!

Answer 29

• Abfolge von Nukleotiden —> Oligonukleotide überlappen partiell und decken so Gen ab! ! • Anwendung!
• Nukleotidpolymorphismus feststellen ! • Problem:!
• Begrenzt durch spezifische Auftragung auf Array —> andere DNA hybridisiert nicht! - man muss Gene kennen!

Question 30

OMICS Technologie

Next-Generation-Sequenzierung!

Answer 30

Sanger-Sequenzierung (klassisch)!

-
Didesoxy-Nukleotid-Sequenzierung; Kettenabbruchmethode!
- man gibt Nukleotide hinzu, die kein 3OH Ende haben
! ! —> wenn diese eingebaut werden, kann Pol nicht weiter Nt anhängen!
!
-
- - -
! => Kettenabbruch!
man erhält unterschiedl. lange Fragmente!
Didesoxy-Adenin (Abbruch direkt bei Adenin); Didesoxy-T/C/G..! Auftragung auf Gel !
mit allen Basen komplette Sequenzierung!

Question 31

Next-Generation-Sequenzierung:

Illumina-Sequenzierung!

Answer 31

Schritte!
1. an DNA-Probe bindet man Linker-Seq.!
2. Probe wird auf Cluster gegeben!
3. Linker binden an Cluster-Linker!
4. Polymerase transkribiert —> viele Millionen Kopien!
5. Hinzugeben von markierten Nukleotiden, welche fluoreszieren, wenn sie gebunden
werden!
• Anwendung!
- Transkriptions-Squenzierung! - RNA-Sequenzierung!
- WGS!
- Cancer genomics!
- Mikrobiom (zB der Hautfauna, man sequenziert alles)! - Single cell transcriptomics!

Question 32

ProteOMICS

Answer 32

nicht nur ein Protein identifizieren!

!• sondern effiziente Methode um viele Proteine in einem Gemisch zu erkennen!

Question 33

ProteOMICS

Massenspektometrie (MS)!

Answer 33

Identifizierung eines Peptids anhand der Masse!
• man kann nur Stücke, keine ganzen Proteine identifizieren! ! => Fragmentierung des Proteins!

Verfahren!
A. MALDI=matrixassistedlaserdesorptionionization! B. ESI=elektro-spray-ioniz.!
LC-MS = Liquid-Chromatographie-MS!
! > Massen werden sauberer, wenn man nur von einem Peptid bestimmt!
! ! als das ganze Gemisch zu bestimmen! man erhält Peaks!
vergleich mit Datenbank!
de-novo-Sequenzierung möglich!
! > man beschießt Peptid mit Partikeln —> Peptid bricht (vorwiegend am Rückrad) !
- proteolyt. Verdau via Trypsin! • MS der Fragmente!
• Fragmente unterschiedliche Massen—> aus Diff erhält man Masse des Peptids/Proteins!
!• Vergleich von versch. Proben schwer!

Question 34

ProteOMICS

SILAC (Erweiterung der MS)!

Answer 34

• stable Isotope labeling with AS in cel culture!
• AS sind mit schweren Isotopen (zB 13C) (Eigenschaften nicht beeinflusst) markiert!
- charakteristische Massendifferenz zw schweren und normalen Peptiden (kann man wegrechnen)!
• eine Probe mit Isotop markiert, andere normal! • eine wird gestresst, andere nicht!
• dann zusammenbringen!
- —> Vergleich des Massendifferenz best. Peptide per MS und gucken inwieweit sich Massenverhältnis geändert hat!

Question 35

ProteOMICS

funktionelle Genomik

Answer 35

!• Bestimmung der Funktion von bestimmten Genen!

Question 36

ProteOMICS

Enhancer trap:!

Answer 36

P-Element (Transposon) aus Drosophila in dem lacZ inseriert ist, in der Nähe der inverted repeats!
• dann Transposition dieses Transposons in der Drosophila, vll springt es dann in der Nähe eines Enhancers, eventueller knock out —> lacZ wird expressioniert —> dann screent man die Probe auf lacZ!

Question 37

ProteOMICS

Gal4 / UAS-System

Answer 37

man kann die Expression eines Enhacers/Promotors betrachten! • Gal4 Transkriptionsfaktor!
• UAS Upstram activating sequence!
• Gal4 funktioniert in vielen verschiedenen Organismen!
!
!
!
!
VL 7 — Genome Editing! !
!
—> dadurch ein Gewebe markieren! —> und gewebespezifische Knock-outs