Cours 7 - clonage

Question 1

quels sont les deu types de clonages?

Answer 1

Clonage et clonage moléculaire

Question 2

Que permet un clonage moléculaire?

Answer 2

Permet de générer un grand nombre de copies identiques d’un fragment d’ADN d’intérêt

Question 3

Insert + vecteur = ADN recombinant

Answer 3

Insert + vecteur = ADN recombinant

Question 4

Nommer des applications de l’ADN recombinant.

Answer 4

• Expression/purification de protéines (ex: insuline, interférons)
• Étude sur la fonction ou la régulation d’un gène d’intérêt
• Préparation de banques de séquençage
• Catalogues de « pièces » d’ADN standardisées

Question 5

Nommer des techniques de clonage.

Answer 5

-Clonage «classique» digestion/ligation
-Clonage de type « Gibson » (homologie)
-Assemblage Golden Gate
-Clonage USER
-Assemblage par recombinaison in vivo

Question 6

Décrire les étapes d’un clonage moléculaire classique.

Answer 6

J’extraie mon vecteur. J’amplifie mon fragment d’ADN d’intérêt. Je digere avec des enzymes de restrictions les deux. Je les ligue.

Question 7

Comment obtenir le fragment d’ADN d’intérêt (insert)?

Answer 7

1- À partir d’ADN (extraction d’ADN génomique, PCR)
2- À partir d’ARN (transcription inverse et PCR)
3- À partir de $$$ (synthèse chimique)

Question 8

Nommer différent type de vecteurs.

Answer 8

Plasmide, Phage, Cosmide, BACs, YACs, MACs

Question 9

Quels sont les éléments de base d’un plasmide?

Answer 9

• Origine de réplication (ori)
• Marqueur de sélection (ex: amp)
• Site de clonage multiple (polylinker)

Question 10

Si je veux que mon insert soit exprimé seulement dans certaines conditions / à certains moments, quel type de vecteur vais-je utilisé? Qu’est-ce qu’on ces vecteurs de particuliers?

Answer 10

Vecteur d’expression, ont un promoteur inductible pour surexpression de protéines

Question 11

Lorsqu’on ajoute une étiquette en N-terminal / C-terminal, quel est le paramètre le plus important à prendre en compte?

Answer 11

LE CADRE DE LECTURE!!! on peut facilement le regarder sur APE

Question 12

Lors de l’assemblage, quels sont les trois cas de figure possible?

Answer 12

• insert dans le bon sens
• Vecteur vide
• insert dans le movais sens (si on utilise deux fois les mêmes amorces)

Question 13

Décrire brièvement les étapes de transformation et de sélection.

Answer 13

Produit de ligation va dans l’organisme d’intérêt (transformation), puis on valide que le plasmide est intégré en platant sur milieu avec l’antibiotique dont une résistance est inclus dans le vecteur. et tu fais ce dont tu as besoin avec la souche.

Question 14

Résumer les étapes de la production d’amorce pour un clonage moléculaire.

Answer 14

1- Trouver la séquence du gène (NCBI, banques de données)
2- Choisir le vecteur de clonage (Google, banques de données)
3- Choisir les enzymes de restrictions à utiliser (ApE)
4- Faire la conception des amorces de PCR (ApE)
5- Générer et valider la construction finale (ApE)

Question 15

Quel type de fichier donne le plus d’information, GenBank ou FASTA?

Answer 15

GenBank

Question 16

Quels paramètres doivent être pris en compte dans le choix des enzymes de restriction?

Answer 16

1) Enzymes de restriction qui ne coupent pas dans votre insert
2) Enzymes de restriction qui coupent une seule fois dans votre vecteur (idéalement) et à un endroit stratégique (MCS)
3) Ne pas utiliser des enzymes qui génèrent des extrémités franches, deux fois la même enzyme (clonage non directionnel), ou qui reconnaissent des sites qui se chevauchent

Question 17

quelle extrémité de l’amorce forme la partie hybridée sur l’ADN?

Answer 17

3’

Question 18

Pour former de bonnes amorces, combien de nucléotides contient minimalement la zone d’hybridation?

Answer 18

18

Question 19

Pour former de bonnes amorces, à quel Tm correspondent les séquences d’hybridation?

Answer 19

50 à 65

Question 20

Pour former de bonnes amorces, combien de nucléotides contient au maximum l’amorce?

Answer 20

30

Question 21

Pour former de bonnes amorces, quel pourcentage GC veut-on?

Answer 21

Entre 40% et 60%

Question 22

Est-ce qu’une bonne amorce peut s’hybrider ailleurs sur l’ADN en plus de s’hybrider sur le gène d’intérêt?

Answer 22

Big no no

Question 23

Qu’est-ce que le GC clamp?

Answer 23

on met un GC à l’extrémité 3’ de la zone d’hybridation pour favorisé l’amplification

Question 24

Si je met un tag en N-terminal, est-ce que je dois enlever l’atg présent? pourquoi?

Answer 24

OUI!! sinon risque d’exprimer deux protéines, le tag + la protéine