Cours #5 et 6

Question 1

6 étapes pour PCR mutagénique

Answer 1

1) PCR du fragment avec ADN matrice et amorces
2) Digestion du fragment avec enzymes de restriction
3) Digestion du vecteur avec enzymes de restriction
4) Purifier sur gel d’agarose
5) Mélanger et liguer avec T4 ligase
6) Transformer dans E-coli + sélection bleu/blanc

Question 2

°C’est quoi une protéine de fusion
°Exemple

Answer 2

°Protéine provenant de deux ou plus gènes différents
°Avec gfp, protéine fluorescente

Question 3

C’est quoi des linker

Answer 3

Des aa hydrosolubles entre deux gènes contenant enzymes de restriction

Question 4

Pourquoi ajouter du foin en 5’ des amorces

Answer 4

Pour que l’enzyme de restriction coupe au bon endroit

Question 5

3 activité assemblage de Gibson

Answer 5

1) Activité exo 5’ (50°C)
2) ADN polymérase
3) ADN ligase

Question 6

5 étapes Gibson

Answer 6

1) PCR de la protéine d’intérêt
2) PCR ou digestion du vecteur
3) Purification des produits sur gel d’agarose
4) Assemblage de Gibson (3 activités enzymatiques)
5) Transformer dans E.coli + sélection bleu/blanc

Question 7

8 étapes PCR fusion

Answer 7

1) PCR des protéines d’intérêts
2) Purification des produits sur gel d’agarose
3) Mélanger les deux produits avec amorces FWD prot 1 et REV prot 2
4) Purification du produit et digestion avec enzymes de restriction
5) Digestion du vecteur par enzyme de restriction
6) Purification sur gel d’agarose
7) Mélanger avec T4 ligase
8) Transformer dans E.coli + sélection