Cours 5 Flashcards
Nomme les bases azotées
Adénine
(une purine) et Thymine (une pyrimidine) d’une part, et les bases Guanine (une purine) et Cytosine (une pyrimidine) d’autre part. Trois liens hydrogènes unissent le C et le G, faisant en sorte que deux brins d’ADN comportant
Qu’est ce que la différence en phénotype et génotype
Le génotype d’une cellule est défini par ses gènes, tandis que le phénotype est défini par ses propriétés.
Décrit ce qu’est un chromosome
Un chromosome est composé d’une double hélice d’ADN généralement circulaire (et
habituellement unique chez la majorité des espèces bactériennes). Il code pour l’ensemble
des fonctions requises par la bactérie (protéines, enzymes, ARN régulateurs, etc.)
Comment est l’ADN chez les procaryotes
Chez les procaryotes, l’ADN chromosomique est circulaire, mais il est linéaire chez quelques espèces (ex : Borrelia burgdorferi). Le chromosome d’E. coli compte environs 4,6 millions de paires de bases, tandis que le génome des mammifères est environ 1000 fois plus grand.
Malgré que le dogme de la biologie moléculaire dictait autrefois que l’ADN se réplique et est transcrit en ARN messager (ARNm) qui est ensuite traduit en protéines qui assurent le métabolisme et les autres activités de la cellule, dont la régulation de l’expression des gènes, existe d’autre composantes
Par exemple, on sait maintenant qu’il existe
de nombreux petits ARN régulateurs et microARN, de même que des structures d’ARN tridimensionnelle (riborégulateurs ou « riboswitch ») qui participent à l’ensemble des
éléments de régulation des gènes.
Quel est le sens des brins?
Chaque brin possède une extrémité 5’ et une extrémité 3’, correspondant à la numérotation
des atomes du sucre désoxyribose de l’ADN.
Quel est le sens dans lesquels les nucléotides sont ajoutés
vers 3’
Explique les composant de la réplication de l’ADN en ARN
La réplication de l’ADN exige la création d’une copie de chacun des deux brins de la double hélice, une réaction catalysée par l’ADN polymérase. Habituellement les deux brins sont copiés au même endroit qui est appelé la fourche de réplication. Les deux brins d’ADN sont déroulés grâce à des hélicases (parce que naturellement ils sont enroulés l’un autour de l’autre) et ensuite séparés pour permettre la synthèse des copies. Une ADN gyrase viendra couper et ligaturer les brins d’ADN en amont de la fourche de réplication de façon à réduire les torsions engendrées par la séparation des brins et le déplacement du complexe de réplication. Les gyrases sont d’ailleurs la cible de certains antibiotiques. Puisque les brins sont en directions opposées, les copies sont aussi en directions opposées. Une copie pousse vers la fourche de réplication tandis que l’autre s’en éloigne. Le brin qui s’éloigne a besoin d’amorces qui sont faites d’ARN grâce à l’ARN primase (voir schéma).
Pourquoi ce réplicage est semi-conservateur
Chaque nouvelle molécule d’ADN contient un ancien brin et un brin nouvellement synthétisé,
Explique ce qu’est la transcription
Lors de la transcription, un brin de l’ADN est copié dans un nouveau langage qui est l’ARN. En plus d’avoir comme sucre le ribose plutôt que le désoxyribose, l’ARN utilise la base uracile plutôt que la thymine.
Que débute la transcription et termine
La transcription commence à une séquence d’ADN particulière qui est appelée promoteur et s’arrête à un terminateur (nous reviendrons plus loin sur ces éléments et la régulation de l’expression des gènes).
Explique la maturation d’ARN
Chez les eucaryotes et certains virus eucaryotes, l’ADN est transcrit en ARN pré-messager dans le noyau. Cet ARN pré-messager contient des séquence codantes, espacées par des séquences non-codantes appelées introns. Ces derniers sont retirés de l’ARN pré-messager par un processus appelé épissage (splicing en anglais). L’ARNm mature ainsi produit est par la suite transloqué vers le cytoplasme, où il est traduit en protéine par les ribosomes.
Explique ARNm, ARNr et ARNt
Il y a 3 principaux types d’ARN : l’ARN messager (ARNm), qui code pour une séquence protéique ; l’ARN ribosomal (ARNr), qui s’associe aux protéines ribosomales pour compléter la formation des ribosomes et les guider au bon endroit pour initier la traduction; et l’ARN de transfert (ARNt), qui est chargé avec un acide aminé qui est ensuite ajouté à la suite d’une chaine naissante d’une protéine, en fonction du code génétique inscrit dans l’ARNm. Ce code permet ainsi de convertir l’information véhiculée dans l’ARNm sous forme de protéine. Tel que mentionné plus tôt, il existe aussi des petits ARN non-codants, et des microARN qui jouent un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes.
Qu’est-ce que la traduction
§ La synthèse de protéines est appelée traduction (translation en anglais). Chaque série de trois nucléotides sur l’ARNm dicte l’incorporation d’un acide aminé. Ces triplets sont appelés codons. Il y a 64 codons possibles pour 4 nucléotides. 61 codons encodent des acides aminés et les trois autres indiquent un arrêt de synthèse (codons stop).
Comment se fait l’initiation de la traduction
Lors de l’initiation de la traduction, un ribosome se positionne sur l’ARNm au codon
d’initiation, qui est presque toujours AUG qui spécifie l’acide aminé méthionine.
Comment se fait l’addition d’acide aminé
Un ARN de transfert (ARNt) contenant un anticodon de séquence complémentaire et chargé d’un acide aminé spécifique vient alors se positionner afin de permettre l’assemblage des acides aminés en protéine.
Chez les eucaryotes, y,a-til de l’epissage? et chez les eucaryotes?
§ Chez les procaryotes la traduction peut commencer avant même que la transcription soit complétée, tandis que chez les eucaryotes, la transcription (et l’épissage) ont lieu tout d’abord dans le noyau, puis l’ARNm mature est transféré dans le cytoplasme où a lieu la traduction (couplée au réticulum endoplasmique rugueux).
Qu’est ce que la répression au niveau de l’étape de la traduction?
§ La répression empêche la synthèse d’une ou de plusieurs enzymes dans une voie métabolique lorsque les organismes sont exposés au produit ultime de cette voie de synthèse, par exemple, si le tryptophane se trouve dans le milieu, il n’est pas nécessaire de le synthétiser.
Qu’est ce que l’induction dans l’étape de la traduction?
§ L’induction initie la synthèse des enzymes d’une voie métabolique quand le substrat initial ou un autre inducteur est présent, par exemple en présence de lactose, les enzymes nécessaires à l’utilisation du lactose sont synthétisées.
Quels sont les 3 types de gênes chez eucaryotes?
Chez les procaryotes, on distingue trois sortes de gènes : les gènes de structure, les gènes régulateurs et les gènes des ARN de transfert ou ARNt. Par gènes de structure, on entend les gènes codant pour des enzymes et des protéines structurales de la bactérie.
Qu’est ce qu’un opérons?
Les enzymes qui ont un rôle métabolique commun sont souvent groupées ensembles sous le contrôle d’un régulateur (souvent un répresseur), d’un site opérateur et d’un site promoteur dans un arrangement appelé opéron.
Qu’est ce qu’un redresseur et un promoteur?
Le gène régulateur est un gène de structure contrôlant la production d’une protéine jouant
souvent le rôle de répresseur.
Le promoteur est un site de l’ADN où se fixe l’ARN polymérase qui assure la transcription des gènes de structure de l’opéron.
Comment se nomme les séquences en amont de l’ARN
On appelle souvent ces séquences la boite -10 ou boite de Pribnow et la boite -35.
Par quoi son reconnue les boites?
Ces boites sont reconnues par un facteur sigma, i.e. une petite protéine qui s’associe avec l’ARN polymérase afin d’initier la transcription. Le facteur sigma permet d’augmenter considérablement l’affinité de la polymérase pour les séquences promotrices par rapport à d’autres séquences d’ADN.
Qu’est ce qu’un sigma alternatif?
Il existe divers facteurs sigma alternatifs dont les niveaux d’expression varient en fonction des conditions de croissance ou des stress métaboliques. Ces facteurs sigma alternatifs
reconnaissent des séquences -35 différentes, permettant ainsi d’exprimer des gènes
différents en fonction des conditions particulières de croissance.
C’est quoi un opérateur dans (opérons)
L’opérateur est un site entre le promoteur et les gènes de structure où le répresseur peut se fixer. Lorsqu’il est présent, l’ARN polymérase ne peut pas lier l’ADN et transcrire les gènes de l’opéron.
Donne un exemple d’opérons indicibles
Chez les opérons inductibles (Fig. 24.12), le répresseur se fixe à l’opérateur en absence de l’inducteur et réprime donc l’expression des gènes en aval. En présence de l’inducteur, le
répresseur est lié par ce dernier, ce qui le séquestre et l’empêche de se fixer sur l’opérateur, activant ainsi l’expression des gènes en aval. C’est le cas de l’opéron lac permettant
l’expression des gènes nécessaires à la l’utilisation du lactose en absence de glucose (source préférée de sucre). En absence de lactose, les gènes ne sont pas exprimés (ils ne sont pas nécessaires au fond !). Mais dès qu’il y a du lactose dans le milieu, la répression est levée et l’expression des gènes est activée, permettant ainsi l’utilisation du lactose comme source alternative de sucre.
Donnes un exemple d’opéron répressibles
Chez les opérons répressibles (Fig. 24.13), le répresseur ne se fixe pas sur l’opérateur en
temps normal, mais seulement lorsqu’il est lié à un corépresseur. C’est le cas de l’opéron
tryptophane, codant pour les enzymes nécessaires à la synthèse du tryptophane. Lorsqu’il y
a suffisamment de tryptophane accumulé dans la cellule, celui-ci joue le rôle de corépresseur
en liant le répresseur, qui se fixe ensuite sur l’opérateur afin de réprimer l’expression des
gènes nécessaires à la synthèse de cet acide aminé. Grâce à ce mécanisme, la bactérie
économise ses ressources de synthèse.
Autre que le lactose, quelle autre mécanisme de glucoses utilisé dans la métabolisation
La régulation de la synthèse des enzymes métabolisant les sucres autres que le glucose
dépend aussi d’un autre mécanisme de contrôle basé sur l’AMP cyclique (AMPc), qui est une
alarmone dérivée de l’ATP. Lorsqu’il y suffisamment de glucose dans le milieu, la cellule
utilisera celui-ci préférentiellement et n’utilisera pas les autres sucres. Dans ces conditions,
les niveaux d’AMPc sont faibles, ce qui fait en sorte que la protéine régulatrice liant l’AMPc
appelée CAP pour catabolite activator protein reste libre et incapable de lier l’ADN. Toutefois,
si la quantité de glucose diminue, la molécule d’AMPc s’accumule et se lie à la protéine CAP
qui peut alors se fixer au promoteur des opérons permettant l’utilisation des autres sources
de sucres, comme l’opéron lactose.
À quoi servent les riborégulateurs?
Un autre mode de régulation ne faisant pas intervenir de protéine et qui permet de contrôler
l’expression de nombreux gènes bactériens repose sur les riborégulateurs. Un riborégulateur
(riboswitch en anglais) est une structure secondaire retrouvée dans la région 5’ non codante
(5’-UTR) de certains ARNm bactériens. Les riborégulateurs reconnaissent de manière
hautement spécifique différents métabolites cellulaires, causant habituellement une
répression de l’expression du ou des gène(s) exprimé(s) en aval du riborégulateur, soit en
bloquant la transcription, soit en bloquant la traduction.
Quest ce qu’une mutation?
Une mutation a lieu quand la
séquence de l’ADN est changée,
soit par la substitution d’une base
pour une autre, i.e. une mutation
ponctuelle, ou suite à l’insertion
ou l’excision de quelques bases,
ce qui engendre un changement
de cadre de lecture.
Qu’est ce qu’un mutation ponctuelle?
§ Les mutations ponctuelles
n’ont souvent aucun effet car
elles ne changent pas la séquence
de la protéine synthétisée. Il est
aussi possible que la mutation
change un acide aminé de la
protéine créant ainsi une
mutation dite faux-sens. Parfois,
cependant, une mutation
introduit un codon d’arrêt créant
une mutation non-sens donnant
lieu à une protéine tronquée et
habituellement non fonctionnelle
(Fig. 24.17).
Qu’arrive-t-il avec l’ajout ou la perte d’un codons
L’ajout ou le retrait d’un
nombre de nucléotides qui est un
multiple de trois ajoute ou
retranche des acides aminés : 3
nucléotides correspondent à un
acide aminé, 6 à deux acides
aminés, et ainsi de suite. Lorsque
l’insertion ou la délétion n’est pas
un multiple de trois, cela modifie
le cadre de la lecture, ce qui
change complètement la
séquence en acides aminés en
aval de la mutation, et donc
modifie la protéine produite.
donnes des exemples d’agents mutagènes
La plupart des mutations sont provoquées par un agent mutagène. Divers produits chimiques
ou alimentaires peuvent réagir avec une base, comme l’acide nitreux (HNO2) qui réagit avec
l’adénine et modifie son affinité pour son partenaire naturel, la thymine. Une telle adénine
modifiée peut maintenant s’apparier avec la cytosine. Lors de la réplication, la paire de bases
A-T normalement formée est maintenant remplacée par une paire A-C ce qui, suite à la
réplication de l’ADN mènera au changement complet de cette paire de nucléotides par G-C
§ Les rayons ionisants, comme les rayons X et les rayons gamma peuvent provoquer une
mutation soit en créant des ions ou radicaux libres qui réagissent avec les nucléotides, soit en
provoquant une cassure d’un des deux, ou même des deux brins de l’ADN (rappel :
l’irradiation est d’ailleurs une méthode de stérilisation pour cette raison, voir cours #4).
§ Les rayons ultraviolets provoquent une réaction entre deux thymines adjacentes donnant un
dimère qui empêche la réplication et la transcription. Un système de réparation doit alors
intervenir pour enlever le dimère et réparer le dommage.
Qu’est ce que la transformation bactérienne
Il s’agit de l’acquisition par une bactérie vivante d’un fragment d’ADN nu provenant d’une
autre bactérie, par exemple une bactérie qui aurait libéré son matériel génétique après sa
mort et la lyse cellulaire. Cet ADN libre est souvent linéaire et pourra éventuellement être incorporé dans le chromosome de la cellule réceptrice. Ce processus se produit naturellement
chez un petit nombre de genres bactériens. On parle alors de « compétence naturelle ».
qu’est ce que la recombinaison génétique?
L’incorporation d’ADN dans un chromosome est
appelée recombinaison génétique. Lorsque les
gènes d’un organisme remplacent les gènes
similaires d’un autre, on parle de recombinaison
homologue (puisque les séquences sont
homologues, i.e. apparentées) et lorsque la
séquence d’ADN insérée est suffisamment
différente de celle du récipiendaire, on parle alors
de recombinaison non homologue (Fig. 3.23, tirée
de Molecular Genetics of Bacteria, 3rd
qu’est ce que la conjugaison bactérienne
§ La conjugaison requiert le contact physique entre
deux bactéries vivantes : une qui est donneuse et
l’autre réceptrice. Il s’agit d’un transfert
unidirectionnel d’ADN (Fig. 24.27).
§ Un type de donneur (appelée F+) donne aux
cellules F-. Il confère la possibilité de fabriquer un
pilus F. Le pilus relie une bactérie F+ à une bactérie
de la même espèce qui est F- et permet le transfert
d’ADN par le pilus.
§ Le facteur F est situé sur un plasmide et la
conjugaison permet de transférer ce plasmide. Si le plasmide est intégré dans le chromosome,
la conjugaison permet de transférer de l’ADN chromosomique en plus du facteur F. Une
bactérie qui contient le facteur F sur son chromosome est appelée Hfr pour high frequency of
recombination.
Explique la transduction
§ Dans la transduction (Fig. 24.28), l’ADN bactérien est transporté d’une bactérie à une autre
par un bactériophage (ou simplement phage) qui s’incorpore dans le génome de la bactérie
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infectée sans le détruire. Lorsque le phage s’excise pour se répliquer, il lui arrive parfois
d’emporter avec lui des petits bouts d’ADN de la cellule hôte, qui seront encapsidés avec
l’ADN du phage. On parle alors de transduction spécialisée. Dans certains cas, seul de l’ADN
bactérien est incorporé dans une capside de phage sans ADN de phage ; on parle alors de
transduction généralisée.
Les bactéries contiennent des plasmides. Qu’est ce qu’un plasmide
Un plasmide (Fig. 24.29) est une molécule d’ADN bicatenaire (i.e. double brin), circulaire
comme le chromosome bactérien, et qui existe dans une bactérie en dehors du chromosome.
Cet ADN se réplique tout seul de façon indépendante à la réplication du chromosome
bactérien. Certains plasmides sont présents à 1 ou quelques copies par cellule seulement,
alors que d’autres peuvent se maintenir à plus de 1 000 copies par cellule.
§ Parmi les gènes portés par les plasmides, on retrouve les facteurs de résistance aux
antibiotiques, des gènes métaboliques permettant d’utiliser certains sucres, ou encore des
facteurs de virulence chez certaines bactéries pathogènes.
Les plasmides jouent un rôle primordial en biotechnologie moléculaire et sont très utilisés
avec les techniques de l’ADN recombinant.
Qu’est qu’un transposons?
Les transposons sont des petits morceaux d’ADN qui peuvent se déplacer d’un endroit à un autre au sein d’un même chromosome, ou encore d’un chromosome à un autre lorsqu’ils sont transférés d’une cellule à une autre. Ils peuvent transporter des gènes de toutes sortes, en particulier des gènes de résistance aux antibiotiques qui sont souvent associés à ce type d’élément génétique mobile.
En biotechnologie, explique la mutation
Le premier outil de la biotechnologie fut la mutation à l’aide de produits mutagènes et la
sélection sur milieu artificiel de mutants ayant les propriétés recherchées. De cette façon on
pouvait isoler de nouvelles bactéries avec des propriétés différentes (comme la résistance à
certains antibiotiques, ou l’incapacité à utiliser certains acides aminés).
§ Aujourd’hui, on peut synthétiser in vitro des gènes entiers avec les mutations voulues et les
insérer dans les bactéries par transformation ou conjugaison par exemple.
En biotechnologie,
§ Les enzymes de restriction sont de précieux outils de biologie moléculaire. Une enzyme de
restriction coupe l’ADN à une séquence spécifique à chaque enzyme. Donc, différentes
enzymes coupent à des séquences différentes sur l’ADN (Fig. 25.2).
§ Ces coupures d’ADN à des endroits spécifiques permettent ainsi d’assembler des fragments
d’ADN provenant de diverses sources afin de créer de toutes nouvelles molécules d’ADN
chimériques.
§ Plusieurs enzymes, en coupant l’ADN, laissent une courte séquence d’ADN simple brin aux
extrémités des fragments, comme une extrémité 5’ protubérante dans l’exemple ci-dessous
(« 5’ overhang » en anglais). Un autre ADN, coupé par la même enzyme, aura la même
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séquence aux extrémités. Grâce à ces extrémités complémentaires cohésives, on peut relier
ensemble les fragments d’ADN de différentes origines et les fusionner grâce à une enzyme,
l’ADN ligase.
QU’est ce qu’un vecteurs dans les plasmides
Les fragments d’ADN peuvent être insérés dans un plasmide (semblable à celui présenté à la
figure 24.29) ou un virus (ex : un phage) qui servira ainsi de vecteur pour la production à
grande échelle d’une protéine ou du produit d’une réaction enzymatique effectuée par une
enzyme clonée.
Qu’est que le clonage
Le processus typique de génie génétique
§ Une étape essentielle au processus typique de génie génétique est le clonage. Il s’agit en fait
d’isoler une séquence spécifique d’ADN et de la répliquer chez une cellule hôte,
habituellement une bactérie comme Escherichia coli. La séquence d’ADN peut provenir d’une
librairie d’ADN ou de gènes, ou être synthétisée in vitro.
Quand on produite de l’ADN en librairie, on doit enlever quoi et comment
Lorsque l’on veut construire une librairie d’ADN eucaryote, on fait face à une difficulté
supplémentaire : les gènes contiennent généralement une ou plusieurs séquences
introniques non-codantes. Il faut donc les éliminer. Pour ce faire, on isole l’ARNm mature,
que l’on converti en ADN grâce au processus de transcription inverse. L’ADN complémentaire
(ADNc) ainsi formé peut ensuite être cloné dans un vecteur pour constituer une librairie
d’ADNc représentant tous les gènes exprimés dans la cellule de départ.
Comment on produit des enzymes
En insérant notre gène d’intérêt en aval d’un promoteur transcriptionnel très fort, il est
possible d’exprimer le produit de ce gène à de très hauts niveaux dans une bactérie. Les
produits plus complexes doivent être parfois exprimés dans une levure ou même une cellule
animale pour obtenir la structure tertiaire typique de la protéine chez l’homme. Le tableau
25.2 présente (à titre informatif seulement) un certain nombre de produits pharmaceutiques
issus du génie génétique.
Séquencage d’ADN cloné, explique
§ Une étape importante de tout processus de clonage est la vérification que la séquence clonée
est correcte et ne contient pas d’erreurs qui auraient pu être introduites pendant le processus.
§ Il existe plusieurs méthodes permettant de séquencer de l’ADN et ce n’est pas l’objectif ici de
les décrire ou de les apprendre. Vous verrez probablement ces techniques dans votre cours
de génie génétique en 3e session.
Explique la sélection des clones
§ Habituellement on introduit un gène de résistance à un antibiotique avec notre gène
d’intérêt à l’aide de plasmides. Il est alors facile de sélectionner les bactéries qui ont acquis le
nouveau plasmide parce qu’elles deviennent résistantes à l’antibiotique lorsqu’on les fait
pousser sur des géloses sélectives avec l’antibiotique approprié (Fig. 25.11).
§ Plusieurs systèmes de clonage utilisent aussi un marqueur supplémentaire, le gène de la b-
galactosidase (lacZ). En présence d’un substrat approprié, l’enzyme produite à partir du
plasmide catalyse la conversion du substrat en un produit coloré qui donne une couleur bleue
aux colonies ayant le plasmide et le gène intact. Si on clone à l’intérieur du gène lacZ, on
empêche la production de la b-galactosidase. Les colonies ont alors une coloration blanche,
ce qui permet de distinguer les clones ayant le gène d’intérêt des clones ayant incorporé le
plasmide vide par exemple.
À quoi sert le PCR
Une méthode couramment utilisée pour isoler un gène de taille relativement petite (i.e.
quelques centaines de paires de bases à quelques kilobases), est la réaction de
polymérisation en chaine ou PCR (Fig. 25.4). Cette technique très puissante est d’ailleurs
couramment utilisée en laboratoire clinique pour détecter et identifier des agents pathogènes
(virus, bactéries).
