Cours 3 Flashcards
Qu’est-ce que la centrifugation?
une méthode de séparation basée sur la force centrifuge (rotation rapide) qui sépare les particules selon leur résistance au mvt (masse, taille, densité…)
Qu’est-ce que le coefficient de sédimentation?
une particule traverse la solution avec une certaine vitesse (débit) de mvt (dépend du poids molaire = taille) et la centrifugation permet la sédimentation + vite
Différence entre ultracentrifugation et centrifugation différentielle?
Ultracentrifugation: rotor vertical ou swinging bucket pour séparer composants (par gradient de densité), pour purification des protéines/a.nucléiques ou pour mesures physico-chimiques.
Centrifugation différentielle: rotor à angle fixe pour faire boulette de protéine insoluble (sédimentation successive, séparation selon taille&masse, commence avec basse force centrifuge)
Quels sont les 2 modes de fonctionnement de l’ultracentrifugation?
- zonal: gradient établi à l’avance dans le tube (sucrose)
2. isopycnique: gradient se forme au cours de la centrifugation (CsCl)
Qu’est-ce que l’on peut déterminer à l’aide de la cytométrie de flux?
activité enzymatique, pH intracellulaire, état du cycle de cellule, expression protéines/ADN/ARN
Comment fonctionne la cytométrie en flux?
des particules/cellules passent à travers un tube étroit entouré d’un liquide d’appoint (tampon) pour focaliser les cellules (queue leu leu) pour ensuite les détecter à l’aider de la fluorescence induite par un laser en combinaison avec la diffusion de la lumière
Quelles sont les 2 majeures classifications et les 5 mécanismes de séparation physique de la chromatographie?
- planaire et sur colonne
2. absorption (partage), adsorption, échangeuse d’ions, affinité, exclusion moléculaire
Différences et similarités de la phase mobile/stationnaire:
Différences:
PHASE MOBILE = rôle de transport (écoulement liquide pour entraîner les solutés à travers la colonne).
PHASE STATIONNAIRE = rôle d’affinité (support solide ou pseudo-solide (ex: silice poreuse) pour retenir les solutés dans la colonne)
Similarités: immiscibles l’un avec l’autre, chimiquement inerte, physiquement actif (interaction avec soluté)
Principe de la chromatographie de partage (absorption):
la phase stationnaire (sur un support) liquide ou sous la forme d’un film mince sépare le soluté (équilibre dans la phase stationnaire et mobile)
Principe de la chromatographie d’adsorption:
soluté en équilibre, soit adsorbé sur la surface de la phase stationnaire ou soit dissous dans la phase liquide
Principe de la chromatographie d’échangeuses d’ions:
séparation des solutés ioniques (chargés) par des forces électrostatiques
Principe de la chromatographie d’exclusion moléculaire:
séparation du soluté selon leur taille (phase stationnaire = réseau polymérique poreux –> 0 interac. avec phase stationnaire)
Principe de la chromatographie d’affinité:
soluté interagit avec phase stationnaire (molécule de reconnaissance (anticorps) greffée sur un support solide (gel de silice)) par forces de Van der Waals
Qu’est-ce que la chromatographie?
séparation des constituants (pour les quantifier) d’un mélange en fonction des vitesses auxquelles ils sont entraînés par une phase mobile à travers une phase stationnaire
Qu’est-ce que le ‘‘k’’ dans les équations de chromatographie?
facteur de rétention (facteur de capacité)
Qu’est-ce que le ‘‘a’’ dans les équations de chromatographie?
facteur de séparation (facteur de sélectivité) (toujours + grand que 1, car le numérateur est toujours + gros; temps de rétention corrigé du 2e analyte toujours + loin)
La forme idéale d’un pic chromatographique est:
gaussienne
Qu’est-ce que N (nbr de plateaux théoriques)?
l’efficacité d’une séparation chromatographique
Comment améliorer la séparation entre 2 pics? (2)
- changer le temps de rétention (K et k) = + espacés dans le temps
- diminuer la largeur des pics (N) pour avoir la capacité de séparer + de composés dans un même graphique
Qu’est-ce que R (résolution chromatographique)?
mesure de l’aptitude d’une colonne à séparer 2 composés (évalué entre 2 pics); si + grand ou égal à 1,5 = idéal
Quelles sont les conditions limites d’un chromatographe? (3)
- manque d’efficacité (pics larges se chevauchants –> diminuer le volume ou la concentration injecté)
- manque de sélectivité (temps de rétention trop semblables –> changer phase mobile/stationnaire ou température)
- manque d’affinité (temps de rétention trop courts –> diminuer la température ou changer phase mobile ou stationnaire)
* dans les 3 cas, la résolution est de + en + faible
Caractéristiques de NP-HPLC:
- phase stationnaire: très polaire
- phase mobile (éluant): - polaire que la phase stationnaire (solvants organiques), force faible si apolaire; fort si polaire
- solutés - polaires sortent en 1er
Caractéristiques de RP-HPLC:
- phase stationnaire: apolaire (C18 ou C8)
- phase mobile (éluant): + polaire que la phase stationnaire (mélange eau + solvants organiques miscibles avec l’eau), force faible si polaire; fort si apolaire
- solutés + polaires sortent en 1er
Avantages & inconvénients des détecteurs d’absorbance UV-vis pour la HPLC:
AVANTAGES: sélectif (choix longueur d’onde), peu sensible à la température et le débit, peut être utilisé en mode gradient, non destructif.
INCONVÉNIENTS: besoin chromophores pour analytes, réponse du détecteur différent pour chaque composé selon ses chromophores, limité par le UV-cutoff pour la phase mobile (après cutoff, phase mobile absorbe)
