Cours 2 Flashcards
Qu’est-ce que l’absorption UV-vis?
promotion d’é à des niveaux + énergétiques
Qu’est-ce que la fluorescence UV-vis?
après absorption, la perte d’énergie électronique avec émission de photons
L’énergie d’excitation est + grande que l’énergie d’émission, alors:
la longueur d’onde d’excitation (absorbance) est + PETITE que la longueur d’onde d’émission (fluorescence)
Qu’est-ce qui favorise la fluorescence?
- rigidité de la molécule
- planarité de la molécule
- milieu + organique
Changement de la fluorescence intrinsèque utile pour:
suivre les changements de structure sec./tert. d’une protéine
Qu’est-ce qu’on utilise lorsque l’absorptivité (epsilon) ou l’émission d’une molécule est trop faible pour être détecté?
- dérivation chimique (lien cov. entre molécule et chromophore)
- marquage par intercalation (lien non-cov. entre molécule et chromogène)
Quelles sont les techniques pour les a.a?
- spectroscopie d’absorption (quelques uns) + avec dérivation chimique
- spectrofluorimétrie si tryptophane (un peu tyrosine et phénylalanine) + avec dérivation chimique
Quelles sont les techniques pour les peptides?
- spectroscopie d’absorption
2. spectrofluorimétrie avec tryptophane, tyrosine et phénylalanine + avec dérivation chimique
Quelles sont les techniques pour les protéines?
- spectroscopie d’absorption
2. spectrofluorimétrie avec tryptophane, tyrosine et phénylalanine + avec intercalant
Quelles sont les techniques pour les a.nucléiques?
- spectroscopie d’absorption
2. spectrofluorimétrie par dérivation chimique + intercalant
Quelles sont les techniques pour les glucides?
- spectroscopie d’absorption par dérivation
2. spectrofluorimétrie par dérivation
Quelles sont les techniques pour les lipides?
- spectroscopie d’absorption par dérivation
2. spectrofluorimétrie par dérivation
Pourquoi y-a-t’il absorption?
car il y a un chromophore sur l’analyte qui est responsable de l’absorption; s’il n’y a pas de chromophore, alors on fait une rx de dérivation chimique
Que dit la loi de Beer-Lambert (A)?
l’absorbance de la lumière est proportionnelle à la concentration, donne un lien quantitatif entre la substance qui absorbe la radiation et la qté de radiation absorbée et permet de construire une courbe d’étalonnage
Spectres d’absorption généraux des protéines:
- à 280 nm = a.a aromatiques (tryptophane, tyrosine, phénylalanine)
- à 200 nm = gr. amides (liens peptidiques: C=O-N-H)
Comment passer de concentration molaire à concentration massique?
multiplier la concentration molaire avec la masse molaire
Comment quantifier les protéines s’il est difficile de le faire par spectrophotométrie d’absorption?
par des méthodes colorimétriques (Biuret, Lowry, Bradford) dont l’intensité (l’absorbance) de la couleur est proportionnelle à la concentration de la protéine
Pourquoi utiliser le ‘‘blanc’’ dans les méthodes colorimétriques?
pour annuler l’absorbance des réactifs ne contenant pas d’analyte que l’on essaie de doser (autres que le protéine)
Principe de la méthode de Biuret (pour mesurer concentration élevée de prot.):
- CHÉLATION: le Cu2+ se lie à l’atome de l’azote dans les liens peptidiques (conditions pH alcalin) = mauve
- RÉDOX: Cu2+ (+) a.a polaires/tryp. tyr. (réduits) –> Cu+ (+) a.a (oxydés)
Principe de la méthode de Lowry (bon choix pour doser protéines avec chromophores pouvant causer des interférences):
comme Biuret + 2e rx de rédox + complexation des ions Cu2+ pour le réduire en Cu+ et réduction du complexe dans le réactif de Fiolin-Ciocalteau = bleu
Principie de la méthode de Bradford:
coomassie, dans des conditions de pH acide, lié de façon non-cov. (ponts H, interac. hydrophobes/ioniques)
Spectres d’absorption des a.nucléiques (pas affectés par sucre, ni phosphate):
longueur d’onde maximale à 260 nm, mais protéines = interférents –> mesure l’absorption à 280 nm
Différence entre un polynucléotide et son nucléotide:
un polynucléotide absorbe - que son nucléotide
Qu’est-ce que l’hyperchromicité?
l’absorption augmente lorsque l’ADN est dénaturé (ARN)(perte struc. sec.)
Dosage des a.nucléiques:
rapport des absorptions à 260 nm (a.nucléiques) sur 280 nm (protéines) + grand que 1,8 indique présence d’ARN; + petit que 1,8 indique la présence de protéines; si = 1,8 alors ADN pur
Qu’est-ce que les quenchers?
ils éteignent l’émission d’un gr. fluorescent (fluorophore)
Le taux d’intercalation de l’ADN avec un fluorophore est directement proportionnel à?
la qté d’ADN
La fluorescence augmente lorsque l’intercalant est lié à:
l’ADN (fluorescence limitée quand intercalant libre)
Qu’est-ce que le FRET?
transfert d’énergie de résonance de la fluorescence = pour mesurer la distance entre les biomolécules
Particularité avec FRET:
lorsque 2 fluorophores sont près l’un de l’autre: le fluorophore donneur transfère son énergie de résonance au fluorophore accepteur (donneur émet pas de photons) –> l’accepteur, excité, fluoresce (longueur d’onde d’émission observée)
Conditions pour effectuer FRET:
- la longueur d’onde d’émission du donneur doit chevaucher la longueur d’onde d’absorption de l’accepteur pour que l’énergie soit transférée
- la distance entre les 2 doit être petite pour que ce soit efficace
Différence entre fluorescence primaire et sec.:
primaire: la molécule émet elle-même de la fluorescence
sec. : la molécule doit être marquée (ex: GFP)
Qu’est-ce que la chimiluminescence?
rx chimique produisant une molécule excitée électroniquement qui émet de la lumière en revenant à son état fondamental (ex: Glow Stick)
