Cours 2

Question 1

Qu’est-ce que l’absorption UV-vis?

Answer 1

promotion d’é à des niveaux + énergétiques

Question 2

Qu’est-ce que la fluorescence UV-vis?

Answer 2

après absorption, la perte d’énergie électronique avec émission de photons

Question 3

L’énergie d’excitation est + grande que l’énergie d’émission, alors:

Answer 3

la longueur d’onde d’excitation (absorbance) est + PETITE que la longueur d’onde d’émission (fluorescence)

Question 4

Qu’est-ce qui favorise la fluorescence?

Answer 4

1. rigidité de la molécule
2. planarité de la molécule
3. milieu + organique

Question 5

Changement de la fluorescence intrinsèque utile pour:

Answer 5

suivre les changements de structure sec./tert. d’une protéine

Question 6

Qu’est-ce qu’on utilise lorsque l’absorptivité (epsilon) ou l’émission d’une molécule est trop faible pour être détecté?

Answer 6

1. dérivation chimique (lien cov. entre molécule et chromophore)
2. marquage par intercalation (lien non-cov. entre molécule et chromogène)

Question 7

Quelles sont les techniques pour les a.a?

Answer 7

1. spectroscopie d’absorption (quelques uns) + avec dérivation chimique
2. spectrofluorimétrie si tryptophane (un peu tyrosine et phénylalanine) + avec dérivation chimique

Question 8

Quelles sont les techniques pour les peptides?

Answer 8

1. spectroscopie d’absorption

2. spectrofluorimétrie avec tryptophane, tyrosine et phénylalanine + avec dérivation chimique

Question 9

Quelles sont les techniques pour les protéines?

Answer 9

1. spectroscopie d’absorption

2. spectrofluorimétrie avec tryptophane, tyrosine et phénylalanine + avec intercalant

Question 10

Quelles sont les techniques pour les a.nucléiques?

Answer 10

1. spectroscopie d’absorption

2. spectrofluorimétrie par dérivation chimique + intercalant

Question 11

Quelles sont les techniques pour les glucides?

Answer 11

1. spectroscopie d’absorption par dérivation

2. spectrofluorimétrie par dérivation

Question 12

Quelles sont les techniques pour les lipides?

Answer 12

1. spectroscopie d’absorption par dérivation

2. spectrofluorimétrie par dérivation

Question 13

Pourquoi y-a-t’il absorption?

Answer 13

car il y a un chromophore sur l’analyte qui est responsable de l’absorption; s’il n’y a pas de chromophore, alors on fait une rx de dérivation chimique

Question 14

Que dit la loi de Beer-Lambert (A)?

Answer 14

l’absorbance de la lumière est proportionnelle à la concentration, donne un lien quantitatif entre la substance qui absorbe la radiation et la qté de radiation absorbée et permet de construire une courbe d’étalonnage

Question 15

Spectres d’absorption généraux des protéines:

Answer 15

• à 280 nm = a.a aromatiques (tryptophane, tyrosine, phénylalanine)
• à 200 nm = gr. amides (liens peptidiques: C=O-N-H)

Question 16

Comment passer de concentration molaire à concentration massique?

Answer 16

multiplier la concentration molaire avec la masse molaire

Question 17

Comment quantifier les protéines s’il est difficile de le faire par spectrophotométrie d’absorption?

Answer 17

par des méthodes colorimétriques (Biuret, Lowry, Bradford) dont l’intensité (l’absorbance) de la couleur est proportionnelle à la concentration de la protéine

Question 18

Pourquoi utiliser le ‘‘blanc’’ dans les méthodes colorimétriques?

Answer 18

pour annuler l’absorbance des réactifs ne contenant pas d’analyte que l’on essaie de doser (autres que le protéine)

Question 19

Principe de la méthode de Biuret (pour mesurer concentration élevée de prot.):

Answer 19

1. CHÉLATION: le Cu2+ se lie à l’atome de l’azote dans les liens peptidiques (conditions pH alcalin) = mauve
2. RÉDOX: Cu2+ (+) a.a polaires/tryp. tyr. (réduits) –> Cu+ (+) a.a (oxydés)

Question 20

Principe de la méthode de Lowry (bon choix pour doser protéines avec chromophores pouvant causer des interférences):

Answer 20

comme Biuret + 2e rx de rédox + complexation des ions Cu2+ pour le réduire en Cu+ et réduction du complexe dans le réactif de Fiolin-Ciocalteau = bleu

Question 21

Principie de la méthode de Bradford:

Answer 21

coomassie, dans des conditions de pH acide, lié de façon non-cov. (ponts H, interac. hydrophobes/ioniques)

Question 22

Spectres d’absorption des a.nucléiques (pas affectés par sucre, ni phosphate):

Answer 22

longueur d’onde maximale à 260 nm, mais protéines = interférents –> mesure l’absorption à 280 nm

Question 23

Différence entre un polynucléotide et son nucléotide:

Answer 23

un polynucléotide absorbe - que son nucléotide

Question 24

Qu’est-ce que l’hyperchromicité?

Answer 24

l’absorption augmente lorsque l’ADN est dénaturé (ARN)(perte struc. sec.)

Question 25

Dosage des a.nucléiques:

Answer 25

rapport des absorptions à 260 nm (a.nucléiques) sur 280 nm (protéines) + grand que 1,8 indique présence d’ARN; + petit que 1,8 indique la présence de protéines; si = 1,8 alors ADN pur

Question 26

Qu’est-ce que les quenchers?

Answer 26

ils éteignent l’émission d’un gr. fluorescent (fluorophore)

Question 27

Le taux d’intercalation de l’ADN avec un fluorophore est directement proportionnel à?

Answer 27

la qté d’ADN

Question 28

La fluorescence augmente lorsque l’intercalant est lié à:

Answer 28

l’ADN (fluorescence limitée quand intercalant libre)

Question 29

Qu’est-ce que le FRET?

Answer 29

transfert d’énergie de résonance de la fluorescence = pour mesurer la distance entre les biomolécules

Question 30

Particularité avec FRET:

Answer 30

lorsque 2 fluorophores sont près l’un de l’autre: le fluorophore donneur transfère son énergie de résonance au fluorophore accepteur (donneur émet pas de photons) –> l’accepteur, excité, fluoresce (longueur d’onde d’émission observée)

Question 31

Conditions pour effectuer FRET:

Answer 31

1. la longueur d’onde d’émission du donneur doit chevaucher la longueur d’onde d’absorption de l’accepteur pour que l’énergie soit transférée
2. la distance entre les 2 doit être petite pour que ce soit efficace

Question 32

Différence entre fluorescence primaire et sec.:

Answer 32

primaire: la molécule émet elle-même de la fluorescence

sec. : la molécule doit être marquée (ex: GFP)

Question 33

Qu’est-ce que la chimiluminescence?

Answer 33

rx chimique produisant une molécule excitée électroniquement qui émet de la lumière en revenant à son état fondamental (ex: Glow Stick)