Cours 2: Les techniques de neurophotoniques Flashcards
Vrai ou faux? La lumière est une onde et on l’utilise pour observer des objets très petits
Vrai, les humains sont devenus très bon avec la lumière (lentille) afin d’observer des protéines, des bactéries ou autres organismes vivants
Quel est la différence entre un microscope et un téléscope?
L’agencement des lentilles qui permet de voir un objet très loin ou très près/très petit
Réviser la diapositive 8
Ok
Qu’est-ce qui a grandement changé dans l’évolution des microscopes depuis les 500 dernières années? (3)
- Élimination des bruits de fond
- Bonne résolution
- Meilleure marquage, meilleur contraste
Qui a créé le premier microscope? Décris le brièvement
Hooke au 17e siècle
Il était formé de deux lentilles. On pouvait voir des cellules avec ce dernier
Qu’est-ce qui a permis d’améliorer le contraste depuis le 20e siècle? (5)
- Les lasers
- L’amélioration des lentilles
- Les microscopes
- Les caméras (hypersensible, refroidi, diminution du bruit électronique)
- Outil génétique afin de modifier le génome des cellules pour y introduire de la fluorescence
Quels sont les différentes caractéristiques des objectifs? (5)
- Immersion
- Grandissement (X)
- Ouverture numérique (NA)
- Distance de travail
- Corrections des aberrations
Quels sont les différents types d’immersion et pourquoi les utilise-t-on? (4)
- Air: En culture cellulaire pour savoir si la culture est prête
- Eau: Échantillons vivants. On met l’objectif dans l’eau directement
- Huile: Les échantillons dans le verre (lamelle de verre, échantillon fixé)
- Silicone
Pourquoi a-t-on autant de choix de matière pour les objectifs?
On utilise beaucoup d’interface différente dans nos échantillons, donc on a plusieurs abbérations possibles
Pourquoi utilisé l’huile pour regarder dans les échantillons de verre?
Car son indice de réfraction est très près de celle du verre
Qu’est-ce que l’ouverture numérique?
C’est le cône de correction de l’objectif
Quels sont les différents types de corrections des abérrations? (2)
- Chromatique
- Plan
Que veut dire l’acronyme WD sur l’objectif?
Distance de travail
Que retrouve-t-on en majorité dans les substances qui font de la fluorescence?
Des cycles aromatiques
Vrai ou faux? Plus les cycles aromatiques sont collés, plus ils émettent de la fluorescence dans le rouge
Vrai
Réviser diapositive 14 du cours 2
Ok
Quels sont les deux filtres nécessaires pour observer la fluorescence?
- Filtre d’excitation
- Filtre de détection (émission) pour isoler une couleur en particulier
Décris le diagramme de Jablonski brièvement
Les photons partent d’un état de base, soit à 0. On les excite, donc ils montent en énergie au niveau S1. Il y a une petite perte d’énergie de certains photons qui vont alors aller faire de la phosphorescence, soit un processus plus lent que la fluorescence. En revenant à leur état basale les photons vont donc libérer l’énergie absorbé en fluorescence.
Réviser la diapositive 15 du cours 2
Ok
Pourquoi utiliser la lumière comme vecteur d’information? (6)
- La lumière est rapide
- Longueur d’onde: Elle est petite, donc utilise une unité petite, donc capable d’interférer avec des entités très petites (donne une bonne résolution).
- On est capable de la contrôler, de l’utiliser pour observer des phénomènes (fluorescence)
- Elle se propage dans l’air, les tissus beaucoup plus facilement que les électrons
- Détecteurs: permet de faire les caméras avec l’effet photoélectrique
- Sondes
Qu’est-ce que l’effet photoélectrique?
L’effet photoélectrique est lorsqu’on envoie des photons sur surface des électrons vont se détacher de cette surface ce qui va venir faire un courant électrique qu’on peut alors mesurer et ainsi déterminer le nombre de photons qui a heurté la surface.
Quels sont les fluorophores chimiques? (4) Pourquoi a-t-on besoin de plusieurs fluorophores différents?
- FITC
- ATTO
- Alexa
- Aromates
On a souvent besoin pour une seule émission de plusieurs fluorophores qui ont des spectres d’absorption et d’émission différents
Vrai ou faux? Plus il y a de cycle aromatique un à la suite de l’autre, plus on est dans le rouge
Vrai
Comment la GFP se protège-t-elle de l’environnement dans lequel elle se trouve?
Elle adopte une forme de baril
Comment a-t-on fait pour changer la couleur d’émission de la GFP?
Des changements génétiques
Pourquoi veut-on faire des protéines de plus en plus vers le rouge?
Car les tissus biologiques et l’eau absorbe et diffracte la lumière rouge, donc on peut aller plus profond dans les tissus
Quels sont les limites d’avoir des protéines fluorescente dans le rouge?
- L’absorption et la diffusion de la lumière rouge par les tissus va également nuire à la fluorescence fait par la protéine
- De plus, à cause des nombreux cycles aromatique
Vrai ou faux? La YFP est sensible au chlore
Vrai.
On voyait cela comme un désavantage au début, car le chlore venait diminuer sa fluorescence.
En revanche, plus récemment on voit cela comme une sonde nous permettant de voir s’il y a du chlore dans la cellule avec les niveaux de fluorescence de cette protéine
Comment peut-on confirmer qu’un gène s’est bien intégré dans un animal transgénique?
Dans ces animaux, on peut remplacer le gène marqué en y ajoutant un gène codant pour une protéine fluorescente afin de savoir si le gène a bien été intégré dans le génome
Quels sont les avantages des sondes et des protéines fluorescentes?
- Peuvent s’intégrer dans le génome des animaux pour savoir si les gènes intégrer dans le génome des souris ont fonctionnés
- Injection de virus pour marquer un type de cellule en particulier
- Fluorophore chimique sont très sensible, robuste, signal intense
Quels sont les limites des sondes et des protéines fluorescentes?
- Les protéines fluorescentes doivent être combiné à des anticorps. Ainsi, pour transmettre cela à l’échantillon on doit s’assurer qu’ils peuvent passer au travers de la membrane, mais également que l’échantillon est fixé et non vivant.
- Perméabilisation de la membrane (endommage la cellule). La taille est importante
Vrai ou faux? Les lasers ont des spectres de longueurs d’onde très fine, donc peuvent être utilisé sans filtre
Vrai
Quels sont les avantages des sources d’illumination?
- Ils ne sont pas divergeant dans l’espace, donc le diamètre du faisceau varie très peu
- Intervalle de longueurs d’onde très petite, donc peu variable
Quels sont les inconvénient des sources d’illumination?
- Plus que le diamètre d’un faisceau est petit, plus qu’il va diverger lors de longue distance
Quelles sont les caractéristiques du microscope à épifluorescence? (5)
- Tout est illuminée
- Image simultanée
- La lumière hors focus est captée
- Rapide
- Possède une caméra
Comment fonctionne le microscope à épifluorescence?
La lumière d’excitation passe au travers d’un premier filtre d’excitation. La lumière qui passe va par la suite réfléchir sur un miroir dichroïque. Elle passe alors dans les objectifs et les lentilles ou elle sera focaliser sur l’échantillon. Les photons vont alors venir exciter l’échantillon. L’échantillon émet de la fluorescence qui retourne vers le microscope. Passe au travers des lentilles sans être focaliser, puis au travers du miroir dichroïque sans être réfléchit. Il passe alors au travers du filtre à émission, puis au détecteur CCD, soit une caméra qui permet d’avoir une image instantanée.
Quelles sont les caractéristiques du microscope à fluorescence point-scan? (5)
- La lumière est focalisée
- Un détecteur permet de détecter la fluorescence pixel par pixel
- Il y a un cône ou pinhole qui enlève la lumière hors focus
- C’est un microscope sensible
- Possède un détecteur PMTs
Comment fonctionne le microscope à fluorescence point-scan?
On a un faisceau d’excitation avec un plus petit intervalle de longueur d’onde. Le faisceau d’excitation réfléchit sur le miroir dichroïque. Il passe dans les lentilles et objectifs en étant directement focaliser sur l’échantillons, à un point précis. L’échantillon fait de la fluorescence. Cette lumière d’émission retourne dans les objectifs et lentilles en divergeant. Il passe au travers du miroir dichroïque, puis au travers d’un filtre à émission. Enfin, la lumière hors focus est couper par le pinhole. La lumière focus continu vers le détecteur unique. Ce dernier va venir refaire l’image pixel par pixel avec un système d’effet photoélectrique.
Réviser la diapositive 27 du cours 2
Ok
À quel degré doit-on mettre le miroir dichroïque?
45 degrés
Pourquoi est-il plus avantageux d’acheter un miroir dichroïque dispendieux?
Plus le miroir est épais plus il reste droit, mais plus il est dispendieux. En effet, lorsque le miroir est moins cher, il est souvent plus mince et courbe facilement, donc lorsque la lumière réfléchit sur ce dernier, elle diverge
Réviser les diapositives 30-31 du cours 2
Ok
Quels sont les deux types de détecteurs caméra?
- emCCD
- CMOS
Quelles sont les caractéristiques de la emCCD? (6)
Elle se nomme la electron multiplying charged coupled device.
1. Nombre limité de noeud pouvant être converti en voltage
2. Très utile pour l’appliquer avec des images ayant un signal faible
3. Elle est refroidi, donc diminu les bruits de fond
4. Taille des pixel: environ 10 micromètre par côté
5. Son temps de lecture est d’environ de 10MHz à 100 kHz
6. Elle fonctionne en faisant un transfert d’électron de la pixel vers une case. Cette case passera dans un amplificateur, puis le courant sera mesuré afin d’obtenir le nombre de photons, donc l’intensité de la fluorescence dans cette pixel.
Réviser la diapositive 32 du cours 2
Ok
Quelles sont les caractéristiques de la CMOS?
Elle se nomme la complementary metal-oxide-semiconductor.
1. Chaque pixel à sa propre conversion charge à voltage
2. Elle requiert un processus lithographique avancé
Vrai ou faux? L’efficacité quantique d’une caméra dépend également de la longueur d’onde
Vrai.
L’effet photoélectrique est également dépendant. Donc si le courant est plus grand dans une case, on va voir une grande différence en comparaison au autre, car il faut également tenir compte de l’amplificateur. Le matériel va également jouer un rôle. Par exemple, certains matériels sont plus efficace dans l’infrarouge ou autre.
De quoi dépend la résolution de la microscopie à champ-large? (3)
- Des lentilles
- Des objectifs
- Tailles des pixels