Corynébactéries Flashcards
Quel est le premier acide aminé à voir été fermenté? Par quel m.o.?
Glutamate/ acide L-glutamique
Par Corynebacterium glutamicum
Gram?
+
Catalase?
+
Uréase
+
Sporulante?
non
Motile?
non
pH?
entre 6 et 8.5
Température?
10 à 40, pas plus
Division cellulaire?
Par cassure
Comment fonctionne la division par cassure?
Les cellules restent attachées après la scission binaire. La cassure aboutit en une disposition angulaire des cellules.
Qu’est-ce que les granules de volutine?
Réserve de polyphosphastes inorganiques.
Sources de carbone utilisés?
glucose, fructose, mannose, maltose, sucrose et tréhalose.
Quel milieu sélectif?
Cystéine-Tellurite (colonies noires)
Qu’est-ce qui distingue corynébactéries des corynéformes?
Les corynébactéries sont des corynéformes, mais pas tous les corynéformes sont des corynébactéries.
Nommer les genres principaux de corynéformes.
Microbacterium
Arthrobacter
Brevibacterium
Propionibacterium
Bifidobacterium
Quels sont les étapes pour produire des mutants surproduction d’acide aminé?
- Utiliser un mutagène pour induire la mutation désirée.
- Isoler les bactéries mutantes.
- Cartographier sur le chromosome bactérien le site de la mutation
Quel mutant on préfère? Délétion ou ponctuel?
Délétion pcq pas réversible et pas de leaky
Quels sont les principaux mutagènes utilisés?
NTG, EMS, acide nitreux
Quel est le défi avec le NTG?
Plusieurs mutations à la fois
Quels sont les 2 types de sélection des bactéries mutantes?
Direct et indirecte
Qu’est-ce que la sélection directe?
On met les mutants sur un milieu qui contient un analogue de la molécule qu’on veut produire.
Ceux qui poussent sont ceux qui ont une mutation dans le feedback négatif, ce qui fait qu’ils n’ont plus de rétroinhibition ou ils y sont plus résistants. Ou encore, l’analogue a moins d’effet allostérique (répression).
Quel est le défi avec la sélection directe?
Trouver la concentration optimale de l’agent de sélection
à quoi sert la sélection indirecte?
Comprendre la voie de biosynthèse (cartographier)
Détection des mutants auxotrophes
QU’est-ce que la sélection indirecte?
On recherche des auxotrophes pour l’a.a. d’intérêt.
On fait pousser les mutants sur un milieu complet.
On les réplique sur un milieu qui ne possède pas l’a.a.
Ceux qui n’y pousse pas sont ceux qui ont la voie de biosynthèse défaillante.
Quelles sont les stratégies pour obtenir des mutants suproducteurs d’a.a. (les buts visés)?
-Élimination génétique des mécanismes de rétroinhibition
-Direction altérée des voies métaboliques
-Augmentation de la concentration d’un substrat pour un enzyme en compétition avec les effecteurs de rétroinhibition
-Diminution de la concentration d’un effecteur ou d’un produit final
-Favoriser l’assimilation des précurseurs
-Inhibition ou inactivation des enzymes de dégradation des a.a. produits
Quel m.o. est majoritairement responsable de la production d’acide L-glutamique?
Corynebacterium glutamicum
Source de carbone pour produire acide L-Glutamique?
Mélasse et hydrolase d’amidon
Glucose, fructose, ribose, maltose, xylose
Source d’azote pour produire acide L-Glutamique?
Sels d’ammonium (NH4Cl, NH4SO3)
Urée
Ammoniaque gazeux
En plus d’être une source d’azote, en quoi est utile l’ammoniaque gazeux?
Permet de maintenir le pH pcq la production d’acide L-Glutamique cause une baisse de pH.
Sans ammonium gazeux en aérobie, le pH diminue. Quel problème cela cause?
L’acide alpha-cétoglutarique est accumulé au lieu de l’acide L-Glutamique
Quel facteur de croissance doit être ajouté et strictement contrôlé pour produire l’acide L-Glutamique?
Biotine
Que se passe-t-il lors du manque d’oxygnène?
Les sucres seront fermentés, acide succinique et lactique de produit, mais pas L-glutamique
Avec quoi la perméabilité de la bactérie entre en relation?
La concentration de biotine
La biotine est un co-facteur de…
acétyl-coA carboxylase
Que fait l’acétyl-coA carboxylase?
Responsable de la biosynthèse d’acide oélique
Où se trouve l’acide oélique?
constituant de la membrane plasmique
Quel est l’impact des acides gras saturés C16-C18?
Diminution de la biosynthèse de l’acide oélique
Que se passe-t-il lorsque Diminution de la biosynthèse de l’acide oélique
Moins de phospholipides dans les membranes
l’accumulation d’acide-L-glutamique est optimale quand la concentration de biotine est …
Suboptimal
Donc moins de biotine, même si meilleure croissance quand +
Que pouvons-nous faire pour optimiser la production si on est en quantité excessive de biotine?
Ajouter de la pénicilline avec un détergent Tween pour permettre l’excrétion de l’acide-L-glutamique lors de lavage au PBS
Céphalosporine et C16-C18 permettent aussi la production d’acide-L-glutamique quand…
quantité élevé de biotine dans le milieu (ex mélasse)
Pourquoi utiliser des détergents et des antibiotiques lors de la synthèse d’acide L-glutamique?
Pour libérer dans le milieu l’acide et éviter l’accumulation intracell et la rétroinhibition.
Si la concentration en biotine est optimale, l’accumulation d’acide L-glutamique est…
faible
Si la concentration en biotine est suboptimale, l’accumulation d’acide L-glutamique est…
grande
Que se passe-t-il avec l’acide oélique et l’excrétion de l’acide L-glutamique quand la biotine augmente?
Augmente
Diminue
Nommer 2 antibios qui peuvent être ajoutés pour augmenter l’excrétion
Pénicilline
Céphalosporine C
Que se passe-t-il avec l’Acide oélique lorsque les acides gras augmentent?
diminue
Quelles sont les 2 voies possibles pour la synthèse de l’acide L-glutamique une fois la glycolyse faite jusqu’au PEP?
PEP en pyruvate
PEP en oxaloacétate
Quelle est le type de fermenteur le plus productif pour l’acide L-glutamique?
Fermentation continue
Pourquoi la fermentation continue demande moins d’énergie?
Parce que la mélasse est visqueuse et est ajoutée graduellement au lieu d’en un seul coup
Le besoin en énergie est moindre en continue. Mais qu’en est-il des besoins en O2?
Ils sont augmentés
Que permet la stérilisation du milieu en continue?
Économie d’énergie
Contrôle qualité
Meilleure productivité
Élimination des bactéries indésirables
Quelle est la concentration optimale finale d’acide L-glutamique?
90-120 g/L
Comment fait-on pour solubiliser l’acide L-glutamique?
Acidification du milieu à pH 3
Quelle est l’étape finale pour obtenir les cristaux d’acide L-glutamique?
Salification de l’acide épuré et cristallisation par évaporation
Quels sont les applications de l’acide L-glutamique?
Rehausser la saveur des aliments (mono-sodium de glutamate)
Additif dans les cosmétiques, savon, shampoing, agent de gélification
Pour quoi sont utilisés la lysine et la thréonine?
Additifs alimentaires
À partir de quoi la thréonine et la lysine sont synthétisés?
Glycolyse, PEP en oxaloacétate en Acide aspartique puis ramification
Comment faire si on veut seulement produire de la thréonine et pas de la lysine?
Obtenir un mutant auxotrophe pour la lysine
Quels sont les 2 gènes en commun pour la thréonine et la lysine?
lysC: aspartokinase (AK)
asd
Quelle enzyme est inhibée par la thréonine et la lysine?
Aspartokinase
Quelles sont les 3 stratégies possibles pour la sélection des souches qui produisent la thréonine?
-Auxotrophe pour lysine et autres a.a.
-Enzyme de régulation mutée
-plasmide/ADN exogène codant pour l’opéron thr
Quelle est le type de bioréacteur le plus fréquent pour la production de thréonine et la lysine?
Fed-batch
Quelle est la source de carbone principale pour la prod de thréonine?
Fructose
Température pour prod de thréonine?
38 puis 28 après 17h
Que doit-on ajouter fréquemment lors de la prod de thréonine ou de la lysine?
Précurseurs de la voie métabolique
Facteur de croissance pour la prod de thréonine ou de la lysine?
Biotine
Comment est recueillie la thréonine?
Centrifugation
Acidification
Augmentation de la concentration
Cristallisation
Séparation du liquide
Séchage des cristaux
Quelles sont les sources de carbone pour la lysine?
Mélasse, acide acétique ou éthanol
Quelles sont les sources d’azote pour la lysine?
sels de NH3 et de NH4+
Urée
à quel pH se fait la prod de la lysine?
neutralité
Comment est recueillie la lysine?
Centrifugation
Absorption sur une résine d’écahnge de cations
Élution avec alkali dilués
Éluat neutralisé avec HCl
Concentration
Cristallisation
Séchage
Quel autre a.a. les corynébactéries peuvent être utilisées?
Tryptophane
Qu’est-ce que la production d’acides aminées par approche enzymatique?
Des enzymes qui dégradent spécifiquement un substrat en l’acide aminé désiré.
Les enzymes sont immobilisés et on achemine le substrat de façon continu
Pourquoi un mutant auxotrophe DAP est pertinent pour la production de la thréonine?
Facilite l’excrétion (moins dans la paroi cell)
+
empêche de faire la lysine
