CM3: Le clonage Flashcards
Quel est l’objectif d’un clonage?
-Isoler une molécule unique d’ADN
-en obtenir plusieurs copies in vivo
Pour
*Banques d’ADNg
* Banques d’ADNc
* Production de protéines recombinantes
* Tests fonctionnels in vivo
* Animaux transgéniques
* Thérapies géniques
Quel est le principe du clonage moléculaire?
On a:
fragment ADN à cloner
–> insert–>vecteur–>ADN ligase–>incorporation
Qu’est-ce qu’un MCS?
C’est un Site Multiple de Clonage permettant l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand.
-il possède plusieurs sites reconnus par des enzymes de restriction
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?
Ce sont des enzymes bactériennes reconnaissant des séquences spécifiques sur l’ADN et qui clivent, de façon symétrique ouy asymétrique, des liaisons phosphosiester sur les deux brins au niveau de ces sites.
Elles clivent les liaisons phosphosdiester des sites consensus spécifiques
Quels sont les éléments d’un plasmide?
-Origine de réplication bactérienne
-Gène de resistance à un antibiotique
–> de sélection positive
-MCS: permet insertion d’un fragment d’ADN
-gène rapporteur
Y-a-il des enzymes de restric1on compatibles avec celles du MCS du vecteur?
NON, on doit désigner der amorces sens et anti-sens pour amplifier par PCR la région d’interêt
Quelle est la 5eme étape du clonage?
Transformation bacterienne–>cultiver dans des mileiux LB avec antibiotique–>selcetion directe
Comment vérifie t-on les clones transformés?
-extraction plasmidique (miniprep)
-digestion par enzymes de restriction
-vérification de la taille des fragments sur gel d’agarose (+BET)
Le clonage est-il directionnel ou aussi non directionnel?
Il y a les deux qui sont possibles
1.Lorsque les enzymes de restriction coupent de manière symétrique les deux brins (ex: EcoRV), comment les appelle t-on?
2.Et quand c’est asymétrique du genre:
5’NNNNNNTCTGTA 3’ GNNNNN
NNNNNNA 3’GACATCNNNNN
1.Des “bouts-francs”, ou “blunt”
2. C’est 3’ sortant
