clonacion celular Flashcards
CLONACIÓN CELULAR:
Permite la amplificación y expresión → in vivo: en células vivas
Se utiliza la maquinaria de replicación de la propia célula
Objetivo: generar un gran número de copias
Anfitriones:
célula a la que le introduces el material genético externo, lo integre y lo replique al dividirse
iInserto:
copia de DNA que le metes a la célula
Vectores:
secuencias del DNA que se pega al inserto para que la célula integre el material genético
enzima de restriccion
Proteínas: enzimas nucleasas: hidrolizan ácidos nucléicos → cortan en sitios específicos del adn
enzimas de retsriccion tipo 2
son las que nos interesan → función de endonucleasa, no necesitan energía, cofactor Mg
- Reconocen las secuencias palindrómicas de 4 a 8 pb → realizan puntos de corte en puntos equivalentes específicos
- Cortan en el enlace 3
P → deja el 3OH y el 5`P
Extremos cohesivos: iguales → afinidad por complementariedad de bases (son los que utilizamos) - Ligasa: une los extremos → cierra la muesca o mella de la secuencia que se cortó → cierra con ATP: rehace el enlace fosfoéster → une OH con 5´P
Aplicaciones de enzimas de restricción:
- Cortar fragmentos específicos que se buscan estudiar
Amplificarlos en PCR
Clonación celular - Mapas de restricción: estudio del conjunto de DNA
Longitud, que y cuantos puntos de corte hay
etapa de preparacion del dna (pcr cel)
Purificar DNA
Cortar con enzimas de restricción fragmentos de interés
Aislar fragmento de interés → electroforesis, centrifugación
Inserto auxiliar como promotor → para expresión
En caso de ser mRNA lo que quieres:
Cebador se une a la cola de poli A → DNA polimerasa amplifica
Transcripción inversa: mRNA → cDNA
Etapa 2: preparación del vector
requerimientos del vector: pequeño, fácil de aislar, secuencia y mapa de restricción conocido, capacidad de replicación autónoma y gen marcador
Corte con la misma enzima que se usó en el inserto → para que sea complementario y se pueda unir por complementariedad
Policonector: secuencias artificiales con diferentes puntos de corte para diferentes vectores e insertos → permite la unión
Plásmidos: más utilizados
DNA bicatenario (2 a 5 kb), circulares, libres
Fáciles de purificar
Insertos de hasta 10 kb
No tienen genes indispensables para las células
Requiere un orígen de replicación
etapa 3: formación del DNA
recombinante → unir el inserto y el vector
DNA recombinante: vector + inserto
Unión covalente → ligasa
Uniones intermolecular:
- Inserto - vector: es la que me interesa
- Vector + vector, inserto + inserto: NO deseada
Etapa 4: incorporación → transformación
Introducción en la célula anfitriona seleccionada → especializadas: adecuadas para el vector y con capacidad replicativa alta → Ej. E. coli
rDNA → replicación
Inserto: se puede quedar unido al plásmido o recombinarse con el cromosoma
Co-transformación: varios genes distintos en el vector
Métodos:
Pasivos y activos
Físicos y químicos: más utilizados
Etapa 5: propagación en cultivo
Células en cultivo → división → clonación
Incorporación: tasa de eficiencia baja
Seleccionar las células que muestran resultados → formas cultivos aislados
Etapa 6: detección y selección de los clones
Simultáneo a propagación
Selección de células con rDNA incorporado → supervivencia en cultivos
Métodos:
Hibridación: sondas con fluorescencia
Inmunoquímicos: anticuerpos para ir hacia la proteína que quieres que se produzca → anticuerpos pegados a donde si está
Genéticos o selección fenotípica: le agregas algo para poder detectarlo → como un gen
Etapa 7: expresión génica
para qué: estudio del proceso, investigar o aplicar el producto
Diferencia: acelular no te deja expresar
Proteínas a la carta → dx, terapia, sensores, detergentes, producción de alimentos, etc
