clonacion acelular repaso Flashcards
CLONACIÓN ACELULAR:
Amplificación de la secuencia de interés SIN utilizar células pcr
PCR
permite aplificar el dna sin usar celulas es invitro, es cualitativa, necesita reconocer la secuencia diana y preparacion del dna para poder amplificarlo y detectar
aplicacion de la pcr
- Clonación acelular de fragmentos de DNA
- Detección de sec. sin purificación
- Preparación de muestras para la secuenciación
- Estudiar polimorfismos de una secuencia
- Rastreo de mutaciones
- Tipificación de DNA para transplantes→ ver compatibilidad
- Diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el prenatal)
- Amplificación del DNA para su clonación
- Detección de microorganismos infecciosos
- Resolver problemas forenses o arqueológicos, estudios evolutivos
- Secuencias específicas de DNA relacionadas con patologías definidas
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Que necesitamos:
pcr
- DNA molde
- Cofactores: buffer y Mg
- Desoxinucleótidos trifosfatos
- DNA polimerasa → termoestable, sin función de exonucleasa
- 2 cebadores o primers: delimitan y son específicas para la región de interés (que se busca amplificar)
pasos pcr
Pasos:
1) Desnaturalización: 75 a 95º → se separan las cadenas (30 a 120 seg)
2) Unión de cebadores: complementarios a la región de interés (10 a 120 seg) (50 a 55º)
3) DNA polimerasa: adición de nt (1 a 3 min) (72º aprox)
Un solo ciclo
Todos los ciclos: 2 horas
Aparato: termociclador → en poco tiempo cambiar las temperaturas, algunos puedes meter muchas muestras
qpcr
qPCR:
Cuantitativa: cantidad de material que se amplifica → se mide cuando se está amplificando (no al final)
Aplicaciones: dosis génica, genotipificar
Componentes: qpcr
Sonda de hibridación: se dirige a una región específica: siempre brilla
Sondas taqman: dirigida a la región de interés → polimerasa empieza a trabajar → corta la sonda → se libera fluorescencia (específica)
Ambas: fluoróforo y quencher (absorbe luz)
Gráfica: qpcr
Gráfica: número de ciclos y cantidad de moléculas → se establece un umbral → que tan rápido la amplificación supera el umbral
Deleción: se tarda - recorre a la derecha → menos material genético
Duplicación: rápido - recorre a la izquierda) → más material genético
RT: PCR:
RT: PCR:
Transcripción inversa: virus de RNA lo pasa a DNA y lo integra al nuestro
Utilización: COVID
Molde: mRNA
Para qué: qué RNA está presente en la célula
tipos de pcr
cualitativa, cuantitativa y retrotrancripcion inversa
dif qpcr y pcr
PCR convencional: es cualitativa (sólo permite detección)–> la diferencia que tiene la cuantitativa es la adición de la onda Taqman y que al cortar la DNA polimerasa corta cada amplicón y emite fluorescencia
Se utilizan (tras la desnaturalización) para cuantificar:
- fluorocromos
- sondas de hibridación
- sondas taqman
- linea base de fluorescencia
- grafica
- ct: ciclo en el que se pasa el umbral (cantidad de fluorescencia detectable por el software
Fluorocromos:
se pegan a todo el DNA→ inespecífico
sondas de hibridación:
van dirigidas a la secuencia diana y brillan, pero también a otras partes (un poco más específicas)
Sondas Taqman:
tienen fluoróforo y su Quencher (absorbe la luz) y va dirigida y se pega en la región de interés → altamente específicas
que pasa cuando dna polimerasa rompe
Cuando la DNA polimerasa rompe la zona de interés flanqueada por los cebadores, el fluoróforo se libera y brilla
grafica (qpcr)
Gráfica: cantidad de fluorescencia emitida (línea y) por número de ciclos (línea x)
ct: ciclo en el que se pasa el umbral
Ct: ciclo en el que se pasa el umbral (cantidad de fluorescencia detectable por el software→ visible en la gráfica y se debe ver en qué ciclo sucede)
- Mientras antes suceda (menos cantidad de ciclos le tome cruzar el umbral), hay mayor material→ línea más a la izquierda
- Si se amplifican más genes se llegará antes al umbral→ más cosas amplificadas = más material
