clonacion acelular repaso

Question 2

CLONACIÓN ACELULAR:

Answer 2

Amplificación de la secuencia de interés SIN utilizar células pcr

Question 3

PCR

Answer 3

permite aplificar el dna sin usar celulas es invitro, es cualitativa, necesita reconocer la secuencia diana y preparacion del dna para poder amplificarlo y detectar

Question 4

aplicacion de la pcr

Answer 4

• Clonación acelular de fragmentos de DNA
• Detección de sec. sin purificación
• Preparación de muestras para la secuenciación
• Estudiar polimorfismos de una secuencia
• Rastreo de mutaciones
• Tipificación de DNA para transplantes→ ver compatibilidad
• Diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el prenatal)
• Amplificación del DNA para su clonación
• Detección de microorganismos infecciosos
• Resolver problemas forenses o arqueológicos, estudios evolutivos
• Secuencias específicas de DNA relacionadas con patologías definidas
  *

Question 5

Que necesitamos:

pcr

Answer 5

• DNA molde
• Cofactores: buffer y Mg
• Desoxinucleótidos trifosfatos
• DNA polimerasa → termoestable, sin función de exonucleasa
• 2 cebadores o primers: delimitan y son específicas para la región de interés (que se busca amplificar)

Question 6

pasos pcr

Answer 6

Pasos:
1) Desnaturalización: 75 a 95º → se separan las cadenas (30 a 120 seg)
2) Unión de cebadores: complementarios a la región de interés (10 a 120 seg) (50 a 55º)
3) DNA polimerasa: adición de nt (1 a 3 min) (72º aprox)
Un solo ciclo
Todos los ciclos: 2 horas
Aparato: termociclador → en poco tiempo cambiar las temperaturas, algunos puedes meter muchas muestras

Question 7

qpcr

Answer 7

qPCR:
Cuantitativa: cantidad de material que se amplifica → se mide cuando se está amplificando (no al final)
Aplicaciones: dosis génica, genotipificar

Question 8

Componentes: qpcr

Answer 8

Sonda de hibridación: se dirige a una región específica: siempre brilla
Sondas taqman: dirigida a la región de interés → polimerasa empieza a trabajar → corta la sonda → se libera fluorescencia (específica)
Ambas: fluoróforo y quencher (absorbe luz)

Question 9

Gráfica: qpcr

Answer 9

Gráfica: número de ciclos y cantidad de moléculas → se establece un umbral → que tan rápido la amplificación supera el umbral
Deleción: se tarda - recorre a la derecha → menos material genético
Duplicación: rápido - recorre a la izquierda) → más material genético

Question 10

RT: PCR:

Answer 10

RT: PCR:
Transcripción inversa: virus de RNA lo pasa a DNA y lo integra al nuestro
Utilización: COVID
Molde: mRNA
Para qué: qué RNA está presente en la célula

Question 11

tipos de pcr

Answer 11

cualitativa, cuantitativa y retrotrancripcion inversa

Question 12

dif qpcr y pcr

Answer 12

PCR convencional: es cualitativa (sólo permite detección)–> la diferencia que tiene la cuantitativa es la adición de la onda Taqman y que al cortar la DNA polimerasa corta cada amplicón y emite fluorescencia

Question 13

Se utilizan (tras la desnaturalización) para cuantificar:

Answer 13

• fluorocromos
• sondas de hibridación
• sondas taqman
• linea base de fluorescencia
• grafica
• ct: ciclo en el que se pasa el umbral (cantidad de fluorescencia detectable por el software

Question 14

Fluorocromos:

Answer 14

se pegan a todo el DNA→ inespecífico

Question 15

sondas de hibridación:

Answer 15

van dirigidas a la secuencia diana y brillan, pero también a otras partes (un poco más específicas)

Question 16

Sondas Taqman:

Answer 16

tienen fluoróforo y su Quencher (absorbe la luz) y va dirigida y se pega en la región de interés → altamente específicas

Question 17

que pasa cuando dna polimerasa rompe

Answer 17

Cuando la DNA polimerasa rompe la zona de interés flanqueada por los cebadores, el fluoróforo se libera y brilla

Question 18

grafica (qpcr)

Answer 18

Gráfica: cantidad de fluorescencia emitida (línea y) por número de ciclos (línea x)

Question 19

ct: ciclo en el que se pasa el umbral

Answer 19

Ct: ciclo en el que se pasa el umbral (cantidad de fluorescencia detectable por el software→ visible en la gráfica y se debe ver en qué ciclo sucede)

• Mientras antes suceda (menos cantidad de ciclos le tome cruzar el umbral), hay mayor material→ línea más a la izquierda
• Si se amplifican más genes se llegará antes al umbral→ más cosas amplificadas = más material