Clase 2 Diagnostico microbiano Flashcards
Que interesa tener en el laboratorio de microbiologia
La identificación del microorganismo que está produciendo la infección.
La sensibilidad antimicrobiana.
Tipos de identificacion y define
Detección directa: encontrar el microorganismo en sí, para lo cual tenemos observación microscópica, cultivo, detección de antígenos con pruebas, como la PCR.
Dirección indirecta: detección de los anticuerpos o serología.
sensibilidad
Sensibilidad: permite dar como positivos los casos realmente positivos, es decir, a una persona enferma, el examen le dará positivo (verdadero positivo).
especificidad
permite detectar la ausencia, es decir, que confirme que no está enfermo si realmente no lo está (verdadero negativo).
Mezcla de sensibilidad y especificidad
De la mezcla de estos dos, aparecen los valores de verdadero positivo, falso negativo, falso positivo y verdadero negativo
Porque necesito muestras esteriles
Porque lo que salga será el patógeno, no hay nada más allí, ya que es estéril. Lo que encontramos es evidente.
En cambio, si tenemos presencia de microbiota como en las muestras de esputo, heces o la orina por micción, será muy difícil discernir entre todas las bacterias.
Que no puedo refrigerar nunca
Hemocultivos
Que no puedo congelar nunca
muestras de cultivo
Que puedo congelar
Muestras de heces para C. difficile
Cuantos niveles de seguridad y en que orden van
4 y el 4 es el mas peligroso
Nivel 1
Es el más sencillo, y se utiliza con microorganismos como E.coli, y consiste en la bata, guantes, lavamanos, muebles fáciles de limpiar, y es lo que veremos nosotros en laboratorios de microbiología.
Nivel 2
consiste en canales de seguridad, antiparras de seguridad, estaciones donde lavar ojos por si hay salpicaduras.
Nivel 3
aquí entran los virus, y se utilizan “trajes similares a los de los astronautas”, ventilación del aire.
Y así va aumentando la seguridad mientras más se complejiza la muestra (más virulencia del microorganismo).
Diagnostico indirecto
su huella es la presencia de los anticuerpos
Imagen microscopia
Real invertida y ampliada
Formula aumento microscopico
Aumento ocular (10) x aumento objetivo (4 a 100)
Para que ocupamos microscopia de campo oscuro
como funciona y ejemplo /1
Los haces de luz incide en la muestra de forma ublicua,
Treponema pallidum (bacteria) (sífilis)
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES para que
Esta técnica utiliza trucos ópticos para traducir los cambios de fase en tonos de grises.
MICROSCOPIO NOMARSKI (DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA)
3D
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Con que se tiñe
Se tiñe la muestra con fluorocromos, que son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados.
Microscopio electrónico. Tipos y nombra 3 usos
Hay de 2 tipos: de transmisión y de barrido
1 Estudios de estructuras internas y moleculares.
2 Estudio de características morfológicas y topográficas (SEM).
3 Estudio de formación de biopeliculas (SEM).
Deteccion Identificacion bacterias
Si, No
Deteccion Identificacion Hongos filamentosos/levaduras
Si, No (hongos filamentosos si, levaduras no)
Deteccion Identificacion Protozoos
Si, Depende
Deteccion Identificacion Virus
No, No
Se ve se efecto citopático en la célula, si se detecta indirectamente
Gram POSITIVO
MORADOS
Gram NEGATIVO
ROSADO
Formas básicas hongos
1 Levaduras
2 Hongos con hifa, que forman filamentos, que son típicos que vemos en el moho del pan
Tecnicas de analisis
1 Fresco
2 10% KOH y azul de lactofenol
3 Lugol con tinción de yodo
4 Tinción china
10% KOH y azul de lactofenol
Se suele utilizar en hongos, donde se ve la hifa teñida y también en cultivos de hongos
Lugol con tinción de yodo
Utilizada para protozoos. Ayuda a teñir los núcleos y la cromatina.
Tinción china
Tipo de tinción negativa que se suele utilizar en Cryptococcus porque ellos tienen una capsula que es hidrófila (repela la tinta china) y se puede observar como un halo alrededor de la levadura
Fresco
es la más simple y es una muestra con agua que se ve en el laboratorio.
Tincion tricromica /1
protozoos en muestras fecales
Tincion plata metenamina /2
hongos, como Pneumocystis jirovecii
bacterias en tejidos, como Legionella
Tinción de Giemsa /5
Protozoos en sangre:
Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania
Bacterias intracelulares:
Chlamydia y Rickettsia
Diferencia Gram NEGATIVA
Las bacterias Gram negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano y además poseen una membrana externa lipídica, es decir, dos membranas.
Tincion gram como funciona
se cubre con cristal violeta, se elimina el exceso de cristal violeta y se agrega yodo, que actúa como mordiente fijando el cristal violeta al peptidoglicano. Si lo observamos, sigue de color violeta.
Luego, se utiliza alcohol-acetona durante 5 o 10 segundos. Este alcohol-acetona disuelve la membrana lipídica externa de las bacterias Gram negativas, eliminando el colorante de la pared.
Como resultado, las bacterias con una capa gruesa de peptidoglicano (Gram positivas) retienen el color violeta, mientras que las Gram negativas pierden el colorante y para observarlas se utiliza una tinción de contraste llamada safranina y quedan de color rosa.
Funcion alcohol acetona en tincion gram
disuelve la membrana lipídica externa de las bacterias Gram negativas, eliminando el colorante de la pared.
que hace que queden rosa las gram negativa
Safranina, tincion de contraste
Tinciones acidas, 3 bacterias donde se ocupan
Aca no sirve la gram
1 actinobacterias
2 actinomicetos
3 cryptosporidium
Tinciones acidas 3 tipos
Ziehl Neelsen utiliza para la tuberculosis
Kinyoun
Ziehl Neelsen modificado
Mycobacterium tuberculosis caracteristicas pared /3
Pared celular con:
1 peptidoglucano
2 arabinogalactano
3 ácidos micólicos
Mycobacterium tuberculosis tincion
Estos ácidos micólicos funcionan como un tipo de cera, por lo que, no se tiñe fácilmente, por tanto, lo que primero que se utiliza es fucsina y la tinción se fija con calor. La muestra con el colorante se coloca en la llama y después se decolora con alcohol ácido (no acetona), para luego diferenciarse se tiñe con azul de metileno. Entonces solo queda teñidos de fucsina aquellas estructuras que presentan los ácidos micólicos, ya que resisten la decoloración con el ácido.
3 tecnicas de tincion raras
Auramina-rodamina
Naranja de acridina
Calcofluor
Que puedo cultivar
Bacterias y hongos
Puedo cultivar protozoos?
Solo en investigacion
Puedo cultivar virus?
Se cultivan en capas celulares, pero no es un trabajo que se haga en un laboratorio de microbiología clínica, esto se haría en investigación.
Tipos medios de cultivo
Solidos
Semisolidos
Liquidos
Agar de donde viene
Alga roja, Rhodophyta
Tipos de medios de cultivo segun caracteristicas
1 Generales
2 Selectivos
3 Enriquecidos
4 De enriquecimiento, como el caldo selenito
5 De transporte, como Cary Blair
6 Diferenciales
7 Especificos
Cultivo Diferencial
aquellos que demuestran una carcateristica particular, por ejemplo el manitol que fermenta la glucosa o desamina algún aa.
Tipos de bacteria segun temperatura /3
Psicrofilicas 10-30 grados
Mesofilicas 30-40 grados
Termofilicas 50-60 grados
MALDI-TOF MS que es y como lo hacen
cultivo de muestra, que es ionizado
Estos iones pasan a través de un espectrómetro de masas que detecta las partículas y genera un perfil,
Identificacion: Nombra tecnicas 7
1 PRUEBAS BIOQUÍMICAS
2 GALERIAS MULTIPRUEBAS
3 SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS
4 MALDI-TOF MS
5 PCR Y RT- PCR
6 PCR CUANTITATIVA
7 SECUENCIACIÓN
PCR y RT- PCR
Se selecciona un segmento del ADN y se amplifica, buscando presencia. También se puede realizar a partir de ARN por ejemplo en virus, donde se pasa a un ARN complementario, para sintetizar y luego amplificar.
Que utilizo para amplificar el ADN y ARN
DNA polimerasa
Transcriptasa reversa.
Diferencias PCR convencional y la PCR cuantitativa /3
Detecta un unico segmento de ADN
Detecta y cuantifica el ADN
La PCR Y RT PCR son reacciones de punto final
qPCR y RT qPCR
La q PCR y la RT-qPCR utilizan la cinética y permiten cuantificar.
Secuenciacion que permite hacer
Nos permite leer que aminoácidos se encuentran en el trozo que amplificamos de PCR. Nos permite leer la secuencia completa, por lo que es la técnica más específica
Secuenciacion, la tecnica mas comun
tecnica de Sanger
Secuanciacion cuando se ocupa
Esta técnica se utiliza cuando surgen dudas o hay una especie que no se ha visto antes.
Dos ventajas tecnicas de amplificacion
Tienen una gran sensibilidad y pueden detectar 1 o 10 microorganismos, lo cual no pasa con los cultivos, que necesitan una mayor concentración.
Tienen alta especificidad
Tecnica indirecta se les conoce como
Serologia
Serologia: pueden ser de tipo
Directa: detección del antígeno (Ag) de la muestra.
Indirecta: detección del anticuerpo (Ac) del suero, LCR (líquido céfalo – raquídeo), fluidos, etc.
Cuando utilizar tecnicas indirectas /4
Cuando el nivel de seguridad es muy elevado
La sensibilidad y especificidad de otros métodos es baja
El diagnóstico directo es difícil; no se puede identificar a través de la microscopía
Sirve también para la epidemiología, protección frente a infecciones y para evaluar prevalencia
TECNICAS DE PRECIPITACION
Se utiliza una matriz (como una “gelatina”) en la que se hacen unos “huequitos” como pocillos donde se coloca la muestra del paciente, y se enfrenta a un anticuerpo o antisuero comercialmente producido, se incuba y al pasar el tiempo las muestras se disuelven en la matriz y llega un momento en que toman contacto formando una línea visible denominada “identidad” lo que se conoce como reacción positiva.
Microfloculacion
Prueba serológica para sífilis, es una técnica de screening que se utiliza para la detección de Ac lipoidales.
Utiliza un Ag que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol, suspendido en un buffer salino, que forma un floculado cuando se combina con Ac lipoidales y no con Ac treponémicos.
Aglutinacion en latex
Las partículas de látex, que pueden ser anticuerpos o antígenos, se enfrentan, por ejemplo, a un suero, líquido cefalorraquídeo o una suspensión bacteriana.
Si el antígeno y el anticuerpo se unen, entonces se forma una reacción visible
aglutinacion en latex para que se ocupa /3
Streptococcus
Cryptococcus
también para la identificación de especies bacterianas
Que detecta la microfloculacion
Ac lipoidales
Banco de diluciones, definicion y caracteristica
Se pueden hacer bancos de diluciones y así detectar el título de anticuerpos
Aquí NO medimos concentraciones, ya que hay otras técnicas que nos proveerán concentraciones, como esto es una dilución, lo que provee es el título.
Inmunohistologia /2
En la imnunohistología evaluamos la presencia de antígenos en superficie de una célula o dentro de ella
inmunofluorescencia puede ser directa e indirecta, podemos detectar el antígeno o podemos detectar el anticuerpo.
inmunocromatográfica donde se utiliza /4
1 Test de embarazo
2 Test del COVID
3 Rotavirus
4 Test VIH
inmunocromatográfica tiene una matriz de
Nitrocelulosa
ELISA que se utiliza
Se utiliza un antígeno inmovilizado y se observan filtros que permiten separar el anticuerpo.
Tipos de ELISA
1 ELISA Directo
2 ELISA Indirecto
3 ELISA en formato de sándwich: en el cual se detecta la presencia del anticuerpo.
4 ELISA Competitivo
WESTERN BLOT que evalua
Evalúa la presencia de proteínas, las cuales se separan mediante un gel de electroforesis y luego son traspasadas a una matriz de celulosa.
Posteriormente, se marcan con anticuerpos específicos que son utilizados para fijar la proteína en la matriz, realizando incubaciones y lavados, y finalmente se visualizan las proteínas marcadas por el anticuerpo
Que permiten las pruebas bioquimicas
Determinar caracteristicas metabolicas, como si fermenta lactosa o glucosa
Microfloculacion es una tecnica de…
Tecnica de aglutinacion antigeno no particulado
Que contiene el antigeno de la prueba de serologica para sifilis
Cardiolipina
Lecitina
Colesterol
La microfloculacion si sale positiva necesita algo mas?
Se debe hacer una prueba confirmatoria con anticuerpos
A que se enfrenta el Banco de diluciones
cantidad definida de antígenos la cual se enfrenta a una concentración decreciente, una dilución del suero del paciente. Entonces, según la afinidad, se producirá en el tiempo la aglutinación de los antígenos y anticuerpos, una aglutinación VISIBLE
ELISA Indirecto
Que puede realizarse mediante el uso de un anticuerpo conjugado, marcado o mediante el empleo de dos anticuerpos, uno primario y uno secundario.
Muestra mas ocupad, especialmente para tecnicas de confirmacion
Western BLOT
Funcion del yodo en la tincion Gram
Yodo, que actúa como mordiente fijando el cristal violeta al peptidoglicano
Con quien utilizar tincion china
Cryptococcus
Tincion tipo para Mycobacterium tuberculosis
Zehl Nielhsen
Cultivo de enriquecimiento
Caldo selenito
Cultivo de transporte
Cary Blair
Bacteria Sífilis
Treponema Pallidum
Detecta resistencia a antibioticos
Metodo de difusion de disco /Kyrby Bauer
Detecta reactividad
Tecnica de aglutinacion con particulas de latex
Detecta la concentracion minima inhibitoria
Dilucion en caldo
Prueba cutanea de turberculina (PPD) desventaja
Dice infeccion previa, no actual
Vacuna SALK tipo de vacuna
Inactivada
Vacunas combinadas
Antigenos de 2 o mas microorganismos
