Chromatographie 2 Flashcards
Qu’est-ce qu’une chromatographie par échange d’ions ?
Dans la chromatographie échangeuse d’ions, la colonne contient une matrice présentant des ions (anions ou cations) de signe opposé à celui des composantes de l’échantillon. Plus la charge d’un ion de l’échantillon est grande, plus cet ion est attiré par ceux de la phase stationnaire et plus son temps d’élution est long.
La phase mobile est un tampon aqueux dont le pH et la polarité peuvent être réglés pour modifier les temps d’élution des composés au travers de la colonne.
Quels sont les paramètres qui affectent la séparation des composés en chromatographie par échange d’ions ?
- La phase stationnaire (DEAE-, CM-, Q-Sepharose, etc) : détermine la charge des ions échangés (anions ou cations) et la force de l’échangeur (fort ou faible)
- Le pH de la phase mobile: affecte la charge nette des composés de l’échantillon (pI)
- La force ionique de la phase mobile: l’interaction est favorisé à faible concentration de sels
- La température: l’interaction est favorisée à basse température
De quoi dépend la force ionique et la conductivité d’une solution ?
La force ionique d’une solution (phase mobile) dépend de la concentration des ions en solution et de leur nature (monovalent, divalent, etc).
La conductivité (siemens/cm, S/cm) d’une solution est directement reliée à sa force ionique. Pour cette raison, un conductivimètre est ajouté à la plupart des appareils à chromatographie.
Cette mesure est utile puisque l’élution des composés est généralement effectuée à l’aide d’un gradient de sels dans la phase mobile.
Quand utilise-t-on un échangeur à cations et un échangeur à anions ?
Un échangeur d’anions est généralement utilisé à haut pH (pH 7-10). Dans cette condition, il a une grande charge positive de surface et les solutés sont souvent chargés négativement (si pH > pI).
Inversement, un échangeur de cations est généralement utilisé à bas pH (pH 4-7). Dans cette condition, il a une grande charge négative de surface et les solutés sont souvent chargés positivement (si pH < pI).
La force de l’échangeur va affecter les conditions qui seront nécessaires pour éluer les molécules fixées (risque de dénaturation des protéines).
Qu’est-ce que la chromatographie d’hydrophobicité ?
Dans la chromatographie d’hydrophobicité (HIC), la colonne contient un adsorbant légèrement hydrophobe. En solution aqueuse et à haute force ionique, les régions hydrophobes présentes à la surface des composés vont se lier au support pour diminuer leur exposition aux molécules d’eau.
La phase mobile est généralement un tampon aqueux riche en sels (souvent le (NH4)2SO4) qui peut être réglé pour modifier les temps élution des composés au travers de la colonne.
Quels sont les paramètre qui affectent la séparation des composés en chromatographie d’hydrophobicité ?
- La phase stationnaire (Butyl-, Phenyl-, Octyl-Sepharose): plus la chaîne aliphatique est longue (C4, C6, C8), plus forte est l’interaction hydrophobe. Par contre, si la résine est trop hydrophobe (e.g. C18), il nécessitera une phase mobile non polaire (solvant organique) pour déplacer les composés liés (dans ce cas, on parle de « reverse phase chromatography » ou RPC)
- Le pH de la phase mobile: affecte la charge nette des composés de l’échantillon (pI)
- Le type et la concentration de sel de la phase mobile: l’interaction est favorisée à haute concentration de sel
La température: l’interaction est favorisée à haute température
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité ?
Dans la chromatographie d’affinité, la colonne contient un ligand immobilisé sur un support solide. L’interaction avec la matrice est spécifique et réversible.
Les interactions récepteur-ligand les plus courantes sont de types:
- enzyme-substrat (-inhibiteur, ou -cofacteur)
- protéine-ADN (-sucre, ou –protéine)
- anticorps-antigène
- récepteur-hormone
- IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)
Quels sont les propriétés qu’une matrice utilisée pour une chromatographie d’affinité devraient avoir ?
- être inerte, pour minimiser les interactions non spécifiques d’adsorption, de partition, d’échange d’ions et d’exclusion stérique entre cette matrice et les biomolécules.
- être poreuse, pour donner accès aux biomolécules.
- être rigide et stable aux conditions de température et de pH requises pour l’adsorption et l’élution du soluté, et pour ne pas se compacter sous la pression requise pour l’écoulement de la phase mobile.
- contenir une forte densité de groupes réactifs pour lier une quantité satisfaisante de ligands.
Qu’est-ce que l’IMAC ?
Par des méthodes biotechnologiques, on peut cloner n’importe quel gène dans un vecteur d’expression de manière à ajouter en N-terminal (ou C-terminal) une étiquette polyhistidine (His-Tag).
Qu’est-ce qu’une chromatographie sur hydroxyapatite (HAP) ?
- Matrice de phosphate de calcium.
- Interaction avec les protéines provient des ions
Ca2+ de l’HAP avec les groupements COO- des a.a.
PO4- de l’HAP avec les groupements NH3+ des a.a. - Interaction avec les acides nucléiques provient des ions Ca2+ de l’HAP avec les groupements phosphates des chaînes ribose-phosphate. (L’ADN double-brins se lie à l’HAP plus fortement que ne le fait l’ADN simple brin)
Qu’est ce que la chromatographie sur membrane ou résine de silice ?
- Principe de purification de la plupart des kits (ADN et ARN)
- Les cellules sont lysées en présence de fortes concentrations de sels chaotropiques (e.g. guanidine thiocyanate, urée) puis l’extrait cellulaire est passé au travers de la résine par centrifugation (l’ADN reste associé à la membrane). Après lavage des contaminants en présence d’éthanol, l’ADN est élué avec une solution aqueuse à pH légèrement alcalin.
