Chromatographie 1 Flashcards
Quel est le principe de base de la chromatographie ?
Méthode de séparation dans laquelle les composants à séparer sont répartis entre deux phases: une phase stationnaire constituée par un lit de matériau (généralement solide) au travers duquel s’infiltre une phase mobile, liquide ou gazeuse.
La classification des différentes techniques de chromatographie est basée sur la nature de ces phases
Qu’est-ce que la chromatographie planaire ?
Lorsque la phase stationnaire est fixée sur un support plat, les molécules sont habituellement séparées et détectées à même le support. Par exemple : chromatographie sur couche mince et chromatographie sur papier.
Qu’est-ce que le Rf (retardation factor) pour les chromatographies planaires ?
RF = a/b
où b = distance de migration du solvant (mesurée à partir du site de dépôt de l’échantillon)
a = distance de migration du soluté (mesurée à partir du centre de la tâche)
Qu’est-ce que la chromatographie d’absorption ?
Aussi appelée chromatographie en phase normale
- permet la séparation de composés de polarités différentes. Ainsi les composés les plus polaires seront plus fortement retenus par la phase stationnaire tandis que ceux qui sont moins polaires seront entraînés par la phase mobile.
• La phase stationnaire est généralement un adsorbant inorganique (gel de silice ou alumine).
• La phase mobile est un mélange de plusieurs liquides dont la polarité est voisine de celle de l’échantillon.
Comment peut-on activer la phase stationnaire dans la chromatographie d’absorption ?
On « active » la phase stationnaire en enlevant ces couches d’eau par chauffage (dans ce cas, on utilise idéalement un support de verre ou d’aluminium). Cette activation peut modifier considérablement le pouvoir de séparation de la phase stationnaire selon les conditions employées.
Des ions métalliques peuvent également être introduits dans le gel pour modifier ses propriétés d’adsorption.
Comment peut-on obtenir la meilleure séparation possible des composés dans la phase mobile et éviter l’évaporation de la phase mobile ?
Pour obtenir la meilleure séparation possible des composés, la phase mobile est habituellement composée d’un mélange de solvants
Pour éviter l’évaporation de la phase mobile durant la chromatographie, il est fréquent de placer un buvard (imbibé de phase mobile) dans la cuve durant la chromatographie.
Comment peut-on visualiser les composés après la chromatographie ?
Plusieurs réactifs (ninhydrine, iode, acide sulfurique, etc) et traitements (chauffage) peuvent être effectués pour mettre en évidence les composés séparés sur la phase stationnaire.
Le gel peut aussi contenir un indicateur fluorescent inerte pour visualiser les composés après la séparation.
Les taches visualisées peuvent aussi être récupérées et analysées par d’autres méthodes.
De quoi dépend la reproductibilité du Rf ?
- qualité et quantité de l’échantillon déposé
- qualité et degré d’activation de la phase stationnaire
- épaisseur et uniformité de la phase stationnaire
- qualité et nature des solvants
- degré de saturation de la cuve
- température et durée de développement
Qu’est-ce que la chromatographie sur colonne ?
Lorsque la phase stationnaire est placée dans une colonne, les molécules sont séparées puis détectées dans les différentes fractions recueillies de l’éluat.
Peu importe la technique utilisée, la séparation des composés repose essentiellement sur une propriété particulière des molécules en jeu (charge, taille, hydrophobicité, etc).
La capacité de séparer deux composés différents va dépendre de leur coefficient de partition (K) pour la phase stationnaire.
Comment calcule-t-on le coefficient de partition (K) ?
Pour les molécules de soluté A :
K =[A] dans la phase stationnaire / [A] dans la phase mobile
Quels sont les paramètres qui peuvent affecter la résolution d’une chromatographie (capacité à séparer deux composés)?
- La capacité de la colonne (quantité maximale d’échantillon que l’on peut déposer avant d’avoir un élargissement des pics)
- L’efficacité de la colonne (largeur des pics) En partie causée par la vitesse de diffusion des molécules dans la phase mobile et le débit de l’élution.
- La sélectivité de la colonne (distance entre les pics ou ΔVe)
Qu’est-ce que la chromatographie d’exclusion (aussi appelée filtration sur gel, chromatographie sur gel, tamisage moléculaire, chromatographie d’exclusion stérique) ?
Dans la chromatographie d’exclusion, la colonne est remplie d’un matériau inerte présentant des pores de dimensions bien définies. Les molécules qui ne peuvent entrer dans les pores vont être éluées rapidement tandis que les molécules qui sont plus petites vont être retardées.
Quels sont les paramètres qui affectent la séparation des composés en chromatographie d’exclusion ?
- La phase stationnaire (Superdex, Sephacryl, Sephadex): aucun support n’est parfaitement inerte (< Ve apparent)
- Le type de gel (G-25, G-50, G-100…): chaque type de gel a son domaine de fractionnement
- Le débit de l’élution (ml/min, cm/hre): perte de résolution si trop vite ou trop lent
- La pression supportée (psi, bar): compaction de la matrice
- La taille des billes (coarse, medium, fine, superfine): 10 μm à 300 μm)
- La hauteur et le diamètre de la colonne (cm): généralement plus que 10:1 (h:d)
- Le volume du dépôt (ml): petit par rapport à Vt (< 5%)
