Amplification PCR et électrophorèse des acides nucléiques Flashcards
Qu’est-ce qu’un amplification PCR ?
Technique de synthèse (in vitro) de fragments d’ADN linéaire.
Expliquez la technique d’amplification PCR.
- ADN double-brin contenant la région que l’on veut amplifier par PCR (dans un tube), On veut séparer (dénaturer l’ADN).
- La température est abaissée pour permettre l’appariement des amorces. La température et ensuite augmenté à 72.
- La température est de nouveau élevée (dénaturation /enzyme = thermostable)
- Au cycle suivant, les 2 amplicons vont générer 4 amplicons. L’amplification de l’amplicon est exponentielle par la suite.
- L’amplicon devient le fragment d’ADN le plus abondant dans le tube (facilite sa détection).
Quelles sont les applications courantes de l’électrophorèse ?
- Estimer la taille d’un fragment d’ADN linéaire.
- Analyser des produits de digestion avec une enzyme de restriction
- Analyser des produits d’amplification PCR
- Séparer les molécules d’ADN ou d’ARN avant buvardage Southern (ADN) ou Northern (ARN).
- Isoler et purifier un fragment d’ADN (Déphosphorylation / marquage radioactif / ligature)
Sur quoi repose la possibilité de séparer les acides nucléiques ?
Le ratio charge/masse des acides nucléiques est constant et la charge nette est négative (à pH 8,0)
La possibilité de séparer les acides nucléiques repose donc uniquement sur une différence de forme (conformation) et de taille (masse).
Comment choisit-on un support pour l’électrophorèse ?
Le support (viscosité du milieu) est dicté par la taille des acides nucléiques à séparer.
- gel d’agarose : bonnes résolutions pour gros fragments
La concentration d’agarose influence la porosité (pouvoir de séparation).
- gel polyacrylamide : bonnes résolutions pour les petits fragments (<3000 pb) (protéines).
Décrivez le pouvoir de séparation du gel d’agarose.
- Très grosse molécule n’entrent même pas dans le gel (millions pb)
- Grosses molécules entre dans le gel, mais ne sont pas séparées. Elles migrent toutes au même endroit sur le gel (environ 25 000pb)
- Molécules plus petites sont séparées et une portion du gel obéit à la relation de linéarité entre log10 taille vs distance de migration.
- Très petites molécules ne sont pas séparées par le gel (<100pb)
Décrivez un électrophorèse sur gel d’agarose en conditions non dénaturantes.
- Ajouter la quantité requise de tampon d’échantillon (tampon de chargement) à chacun des échantillons. Ce tampon contient habituellement du glycérol (ou du sucrose) qui augmente la densité de l’échantillon, du tampon et un colorant (bleu de bromophénol) pour suivre la progression de l’électrophorèse.
Quels sont les effets de la conformation de l’ADN dans le gel.
- Forme relâchée (relaxed DNA) dans le haut du gel
- Forme superenroulée dans le bas du gel (migre plus rapidement)
- Forme linéaire migre entre la forme relâchée et la forme superenroulée.
- Les standards sont toujours linéaires.
Quel est l’effet de la taille de l’ADN linéaire dans le gel ?
Les fragments les plus courts migrent plus rapidement.
Pour quelle région de la courbe standard de migration est-elle linéaire ?
Pour une concentration d’agarose donnée, il y a une région où la distance parcourue est inversement proportionnelle au log de la taille (pb) de l’ADN. (Région linaire de la courbe standard de migration.)
Quel est le but de faire un électrophorèse sur gel d’agarose en conditions dénaturantes ?
Le but est d’éliminer l’effet de la conformation (ADN simple-brin, ARN simple-brin) pour pouvoir séparer que selon la taille.
Le gel contient un ou des agents dénaturants et l’électrophorèse est effectuée à plus haute température.
En quoi consiste l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) ?
La présence d’un gradient d’agent dénaturant dans le gel permet de séparer des fragments d’ADN de même taille, mais pas de même composition (séquence différentes).
- Utile pour différencier des populations bactériennes
En quoi consiste l’électrophorèse en capillaire ?
- Au lieu de faire l’électrophorèse dans un gel polymérisé, le support est un polymère liquide contenu dans un long capillaire permettant de séparer avec une grande résolution les fragments d’ADN.
