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Biologie moléculaire > chapitre 5 > Flashcards

chapitre 5 Flashcards

1
Q

qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?

A

sont des endonucléase, sont des enzymes capables de reconnaitre une séquence spécifique d’ADN et de cliver la molécule à ce niveau

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Q

les enzymes de restriction proviennent de quoi?

A

de bactérie qui les utilisent pour éliminer tout ADN étranger en le clivant, inactif (système de défense)

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Q

que doivent posséder les bactéries produisant des enzyme de restriction? et pourquoi

A
  • doivent possédé en contre partie des enzymes capables de modifier leur propre ADN pour le protéger des coupures
  • dhab ce sont des méthylases qui ajoutent un groupement CH3 à une des bases à l’intérieur du concensus
  • permet de distinguer leur ADN de l’ADN étranger
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3
Q

qu’est-ce qu’un site de restriction et de quoi sont-ils composés?

A
  • enzyme de restriction reconnaissent les sites de restriction composés de 4 à 8 nucléotides et qui clivent l’ADN au niveau de ces séquences
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4
Q

que sont la plupart des sites de restrictions, et qu’est-ce que ça veut dire? qu’est-ce que cette conformation forme?

A
  • plupart des sites de restriction sont des palindromes
  • lorsque leur séquence est identique sur les 2 brin lorsque lu de 5’ à 3’
  • forme des brins d’ADN symétrique l’un par rapport à l’autre
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5
Q

sous quelle forme sont la majorité des enzymes de restriction? que font ces sous-unités?

A

sous forme de dimère
- chaque sous-unité de la prot se fixe sur un des 2 brins localement identiques de la mol d’ADN et coupent un lien entre 2 nucléotides spécifiques. chaque sous-unités agissant sur l’un des deux brins

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6
Q

les positions de coupe diffère selon quoi?

A

selon l’enzyme

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7
Q

quand y a-t-il des extrémités franches et qu’est-ce que c’est?

A
  • lorsque les 2 brins coupent leur site vis à vis, il y a des extrémités franches
  • c’est à dire qu’aucun nucléotide simple brin n’émergera su site de coupure, les deux brins sont complet
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7
Q

quel est le deuxième type de coupure?

A

coupure cohésive

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8
Q

quels sont les deux exemples de coupure cohésive?

A
  1. EcoRI coupe toujours entre le G et le 1er A de la séq, car ce lien se situe du côté 5’ de la séquence de restriction, la coupure laissera derrière une ext. 5’ simple brin
  2. Kpnl le site de coupure se situe du côté 3’ de la séq ce qui produit des extrémités simples brins libres en 3’
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9
Q

l’enzyme de restriction coupe-t-il toujours le même sur les deux brins?

A

oui, le lien coupé est oujours le même sur les deux brins

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10
Q

de quoi dépend le site de coupure?

A

de la séquence reconnue

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11
Q

qu’arrive-t-il lorsqu’une même séquence d’ADN est là plusieurs fois?

A

toutes les copies d’une même séquence d’ADN sont coupées au même endroit TOUJOURS

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12
Q

qu’arrive-t-il lorsque les séquences sont très courtes?

A

de bonnes chances d’être présents +s fois dans un génome

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13
Q
A
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14
Q
A
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15
Q

quelle est la différence lorsque e* coupent entre les sites à 4 nucléotides ou 6-8 nucléotides?

A

4: produisont des fragments de quelques centaines de pb
- 6-8: frag + long

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16
Q

à quoi sert la cartographie de restriction?

A

moyen rapide de comparer des séquences appariées

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16
Q

comment marche la séparation par électrophorèse? et à quoi ça sert?

A
  • visualisation des fragments d’ADN
  • parce que ADN -, il va vers borne +
  • en migrant sur gel d’agarose, sépare les fragments selon leur longueur
  • plus long, plus lent
  • on concentre en un seul endroit toutes les mol du meme fragment
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17
Q

que produisent les coupures cohésives?

A

produisent des extrémités libres compatibles entre elles

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18
Q

quelle est la caractéristique la plus utile des e* de restriction?

A

leur digestion asymétrique des deux brins au site de restriction qui produits des extrémités cohésives

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19
Q

de quoi sont issues les extrémités cohésives?

A

sont issues de séquences complémentaire, elles restent donc complémentaire l’une à l’autre

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20
Q

qu’arrive-t-il si 2 séquence distinctes contiennent le même site de restriction?

A

leur digestion avec cette e* produira des extrémités compatibles entre les deux séquences

21
Q

qu’arrive-t-il quand on mélange ces frangments d’ADN coupé?

A

leurs extrémités complémentaires peuvent s’apparier à base T°

22
Q

que fait la ligase une fois que les extrémités complémentaires sont appariées à basse T°?

A

ADN ligase relie les nucléotides adjacents, formant une nouvelle séquence recombinée avec un site EcoRI recréé, combine frag originaux en 1 seul ADN hybride

23
Q

pour recombiner deux séq d’ADN, doit-on avoir le même site de restriction?

A

non, pas nécessaire qu’elles possèdent le même site de restriction, mais doit avoir extrémité cohésives complémentaire

23
Q

comment fonctionne l’ADN ligase (fragment compatible?) ?

A
  • seul le frag a est compatible avec l’extrémité de l’ADN a’
  • les extrémités cohésives a et a’ peuvent s’apparier
  • ligase soude les nucléotides adjacents
  • ligase viendra ensuite attacher le OH en 3’ de chacun des frag du phosphate en 5’ de nucléotide adjacent pour créer un nouvel ADN composé des 2 seq recombinées
24
Q

qui sont les acteurs à la base du clonage de l’ADN?

A
  • e* de restriction
  • e* de ligation
25
Q

à quoi servent les plasmides bactériens?

A

à recopier l’ADN recombiné

26
Q

comment fait on pour avoir un plasmide vesteur de clonage?

A
  • plasmide sont réintégrés par la bactérie et elle se réplique ++ (donc plasmide aussi)
  • on isole après ces population bactérienne qui répliquent toutes le même fragment d’ADN introduit dans le plasmide
27
Q

qu’est-ce qu’un plasmide? comment peut-il être échanger de b en b? comment b peuvent le capter?

A

sont des molécules circulaire d’ADN double brin qui existe naturellement chez les b et certains eucaryote uniCR
- par conjugaison
- captés de l’environnement par les b
-

28
Q

quans est répliqué ADN plasmatique?

A

répliqué avant la division CR et partagé entre les c filles

29
Q

que doivent contenir les plasmides pour être utilisé pour clonage en labo?

A
  • origine de réplication
  • marqueur de sélection, souvent gène de résistance
  • site de multiclonage (MCS) permettant l’insersion de frag de restriction
30
Q

qu’est-ce que le site de multiclonage?

A

série de site de restriction parmi lesquels on choisira un site adéquat pour recombiner le vecteur avec les séquence d’intérêt.

31
Q

qu’est-ce qu’un vecteur de clonage? et comment sont-ils pour utilisation en labo?

A

plasmide utilisé en labo pour clonage ont été modifiés et ne contiennent que les éléments minimal nécessaire

32
Q

de quoi est constitué les site de multiclonage?

A

succession des sites de restriction reconnus par les enzymes indiquées

33
Q

quels sont les nouveaux défis du séquençage du génome humain?

A
  • savoir séquencer l’ADN
  • obtenir l’ADN sous forme manipulable (banque génomique)
  • automatiser le processus et le rendre possible à grande échelle
  • assembler les données ( bio informatique)
34
Q

comment fonctionne la méthode de Sanger?

A
  • aussi appelé méthode de terminaison
  • utilise des rx de polymérisation in vitro pour déterminer les séquences d’ADN
  • ## synthétise des mol d’ADN compl à la matrice à séquencer grâce à ADN pol et une amorce spécifique
35
Q

quelle est l’utilité des ddNTP dans la méthode de Sanger?

A

pour arrêter la rx à un nucléotide spécifique, comme les ddNTP n’ont pas de OH en 3’, dès qu’ils sont insérés dans la chaine d’ADN, la rx ne peut aller plus loin

36
Q

grâce à quoi il est possible de produire des fragments d’ADN précis?

A

grâce à la synthèse chimique de courtes séquences d’ADN simple brin
appelés oligonucléotides

37
Q

comment se déroule la synthèse d’oligonucléotides?

A
  • synthèse automatisée, et utilise des phosphoamine «protégé» pour ajouter les nucléotides un à un
  • ces oligonucléotides peuvent s’hybrider à un ADN simple brin servant d’amorces pour ADN pol qui synthétise une séquence compl. à partir d’un point précis

-ajout de nucléotides masqués
- la rx chimique se fait par l’ajout de nucléotide en 5’
- le masque est retiré
- le nucléotide suivant est ajouté

38
Q

peut-on prédire où une synthèse particulière va arrêter?

A

non, mais on sait que c’est aprés avoir introduit ddCTP

39
Q

comment se fait le séquençage de l’ADN?

A
  • ADN matrice est dénaturée
  • amorce compl. radiomarquée y est hybridée
  • échantillon contebant +s copies de la matrice avec l’amorce hybridée est séparée en 4 tubes identiques ( contiennent ADN pol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
  • chaque tube contient en plus un seul didésoxynucléotide
  • rx de terminaison de chaine se déroulent et lees produits accumulés dans les 4 tubes sont analysé par l’électrophorèse
40
Q

quelle est la diff entre séquençage de Sanger et séquenceur automatique?

A

même rx de terminaison, mais 4 les didésoxyribonucléotides sont ajoutés en mm temps
- chaque fragment généré a une couleur correspondant au didésoxyrinucléotide qui a causé l’arrêt

41
Q

qu’est-ce que le séquençage shot gun?

A

nécessaire de frangmenter l’ADN ++
l’ADN est fragmenter en banque de frag de diff taille, chacune analysées +s fois pour une meilleur couverture

42
Q

comment est fait la construction d’une banque?

A
  • ADN est fragmenté et isolé
  • les fragments sont attachés à un vecteur plasmidique
  • les vecteurs sont insérés dans des bactéries et chacun se développent indépendamment
43
Q

comment se déroule l’assemblage/ordonner?

A
  • après obtention de tous ces morceaux, il faut les ordonner pour générer le patron du génome recherché
  • pour ordonner les frag générés doivent se répéter sur une certaine longueur
  • grâce à traitement informatique, il est possible de déterminer que la séq. à l’extrémité d’un fragment correspond à celle d’un autre frag et donc les positionner un par rapport à l’autre
44
Q

quel est le matériel nécessaire à la réaction de PCR?

A
  • ADN pol résistante au hate T° (thermorésistance_
  • ADN matrice
  • amorces spécifique capables de s’hybrider à chaque brin de l’ADN matrice (permet à pol d’initier rx polymérisation)
  • nucléotides (pour générer nouveaux brins d’ADN)
  • thermocycleur ( permet de changer rapidement la T°)
45
Q

à quoi sert la rx de PCR et quelles sont les deux amorces?

A
  • générer fragments d’ADN précis et en grande qté
  • amorce 1: amorce sens, car elle va dans même direction que ce brin
  • amorce 2: amorce anti-sens, car va dans direction du brin complémentaire
46
Q

quelle est l’étape 1 de la PCR?

A
  • aug T° pour dénaturer brins de ADN matrice
  • T° baissée pour permettre hybridation des amorces à chacun des brins de la matrice
  • T° remontée rapidement à T° optimal pour ADNpol
  • à ce stade, la pol a complété les brins compl. à la matrice à partir de l’endroit où les amorces se sont hybridées
  • ensuite, on rfait pareil, mais cette fois, 2 molécules pourront servir de matrice
47
Q

quelle est l’étape 3 de la PCR?

A
  • 3e cycle, après dénaturation, on a déjà obtenu tous ces brins
  • à ce stade, les 1er produits d’amplification apparaissent ( ce sont ces mol, encadrées par les séq des deux amorces, qui doubleront à chaque cycle et qui donc seront amplifiés par la rx)
47
Q

quelle est l’étape 2 de la PCR?

A
  • 2e cycle, la T° est aug à 94°C pour dénaturer ADN
  • abaissée pour permettre hybridation des amorces
  • et remontée pour permettre l’élongation par ADN pol
48
Q

quelle est l’étape 4 de la PCR?

A
  • au 4e cycle, les 2 molécules encadrées par les amorces obtenus au cycle d’avant sont maintenant 8
49
Q

quelle est l’étape 5 de la PCR?

A

rendu à 22

50
Q

qu’arrive-t-il au nombre de frag de pcr à chaque cycle? et nombien au total?

A

le nombre de frag double à chaque cycle pour croire de façon exponentielle
- 1 milliard de mol par molécules de matrice initiale, car environ 30 cycles

51
Q

exmples d’application de la PCR (7)?

A
  • identification de polymorphisme
  • diagnostic d’infection
  • diagnostic anténataux
  • en combinaison avec d’autres techniques
  • RT-PCR expression de gènes
  • recherche de séquences spécifiques
  • mutagène
52
Q

comment fonctionne le séquençage à haut débit?

A
  • plus efficace que la méthode de sanger
  • l’étape limitante dans le séquençage du génome est de recombiner les frag d’ADN pour les séparer et les dupliquer
  • les frag d’ADN sont liés à des microbilles à une dilution assurant la liaison d’un frag de billes
  • les billes sont séparées dans des micropuits
  • ADN est amplifié par PCR sur les billes
  • ADN de chaque puits peut être séquencé en parallèle

Biologie moléculaire (9 decks)

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